收集源自神经系统细胞的细胞外囊泡的方法

1.本说明书公开了收集源自神经系统细胞的细胞外囊泡的方法、检测神经精神障碍的方法、收集源自神经系统细胞的成分的方法、收集细胞外囊泡的试剂和检测含有该试剂的细胞外囊泡的试剂盒。


背景技术：

2.专利文献1公开了阿尔茨海默病和其他神经退行性疾病的生物标志物以及诊断和预后方法。专利文献2公开了检测从生物样品分离的囊泡(例如，外泌体)中的生物标志物以用于阿尔茨海默病和其他神经退行性疾病的诊断和预后。专利文献3公开了用于定量外泌体亚群的方法以及神经退行性疾病(例如阿尔茨海默病)的诊断和预后方法。专利文献4公开了如何在神经疾病、免疫疾病、胎盘疾病、癌症、血液疾病、肾脏疾病、胃肠疾病、肝脏疾病和肌肉骨骼疾病的诊断和预后方法中使用外泌体和外泌体生物标志物。
3.参考文献清单
4.专利文献
5.专利文献1：wo2015/061634
6.专利文献2：wo2017/193115
7.专利文献3：wo2018/094120
8.专利文献4：wo2019/144056。


技术实现要素：

9.技术问题
10.专利文献2～4公开了外泌体在神经退行性疾病的诊断和预后中的用途。然而，例如，专利文献2中记载的用于收集外泌体的ncam或cd171不是神经系统细胞特有的蛋白质。为了有效地收集源自神经系统细胞的细胞外囊泡，需要使用对其他神经细胞具有高度特异性的蛋白质来收集源自神经系统细胞的细胞外囊泡。
11.本发明解决了如下问题：提供一种以提高的效率收集源自神经系统细胞的细胞外囊泡的方法。
12.问题的解决方案
13.由于勤奋研究的结果，本发明人发现，通过针对存在于细胞外囊泡中的aplp1进行免疫沉淀，可以有效地收集源自神经系统细胞的细胞外囊泡。
14.本发明包括，例如，以下方面作为实施方式。
15.项1、一种收集源自神经系统细胞的细胞外囊泡的方法，其包括将抗-aplp1抗体和含有细胞外囊泡的样品混合以形成抗-aplp1抗体和细胞外囊泡的复合物的步骤，以及收集抗-aplp1抗体和细胞外囊泡的复合物的步骤。
16.项2、根据项1所述的收集细胞外囊泡的方法，其中，所述含有细胞外囊泡的样品包含从试样中粗纯化的细胞外囊泡。
17.项3、根据项1或2所述的收集细胞外囊泡的方法，其中，所述粗纯化通过尺寸排阻色谱法、超速离心法、亲和纯化法、聚合物沉淀法或其组合进行。
18.项4、一种检测神经精神障碍的方法，其包括从根据权利要求1至3中任一项所述的方法所收集的细胞外囊泡中获得作为神经精神障碍的生物标志物的多肽和/或多核苷酸的测量值的步骤，和将所述测量值与相应的参考值进行比较以确定所述测量值是在参考范围内或在参考范围之外的步骤。
19.项5、根据项4所述的检测神经精神障碍的方法，其中，所述神经精神障碍选自神经退行性障碍、脑脊髓外伤后神经功能障碍、脑肿瘤、感染相关性脑脊髓障碍、多发性硬化症、精神分裂症和躁郁症。
20.项6、根据项5所述的检测神经精神障碍的方法，其中，所述神经退行性疾病选自痴呆、帕金森病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、进行性核上性麻痹、多系统萎缩症和三联体重复序列疾病。
21.项7、一种收集源自神经系统细胞的成分的方法，其包括从通过根据项1至3中任一项所述的方法收集的细胞外囊泡中收集选自糖、脂质、多肽和多核苷酸的至少一种生物分子的步骤。
22.项8-1、收集细胞外囊泡的检测试剂，其包含抗-aplp1抗体。
23.项8-2、根据项8-1所述的检测试剂，其中，所述细胞外囊泡源自神经系统细胞。
24.项8-3、一种包含抗-aplp1抗体的检测试剂，其中，所述检测试剂用于实施根据项1至3中任一项所述的收集细胞外囊泡的方法，实施根据项4至6中任一项所述的检测神经精神障碍的方法，或实施根据项7所述的收集源自神经系统细胞的成分的方法。
25.项9-1、一种检测试剂盒，其包括用于收集细胞外囊泡的包含抗-aplp1抗体的检测试剂。
26.项9-2、根据项9-1的检测试剂盒，其中，所述细胞外囊泡源自神经系统细胞。
27.项9-3、一种检测试剂盒，其包含含有抗-aplp1抗体的检测试剂，其中，所述检测试剂盒用于实施根据项1至3中任一项所述的收集细胞外囊泡的方法，实施根据项4中6中任一项所述的检测神经精神障碍的方法，或实施根据项7所述的收集源自神经系统细胞的成分的方法。
28.发明的有益效果
29.根据本发明，可以提供收集源自神经系统细胞的细胞外囊泡的改进的有效方法。
附图说明
30.图1显示了从血浆中收集的细胞外囊泡的western印迹法结果。
31.图2显示了从ips细胞分化的神经细胞的培养上清液中收集的细胞外囊泡的western印迹法结果。
具体实施方式
32.1.收集细胞外囊泡的方法
33.本实施方式涉及收集源自神经系统细胞的细胞外囊泡的方法。收集细胞外囊泡的方法包括混合抗-aplp1抗体和含有细胞外囊泡的样品的步骤和收集抗-aplp1抗体和细胞
外囊泡的复合物的步骤。在收集细胞外囊泡的方法中，抗-aplp1抗体和细胞外囊泡的复合物可以通过将抗-aplp1抗体和含有细胞外囊泡的样品混合来形成。
34.细胞外囊泡是大小为数十至数千nm左右并被以从细胞中释放的磷脂为主要成分的膜所覆盖的颗粒。细胞外囊泡包括外泌体、微囊泡、凋亡小体等。生物分子通常存在于细胞外囊泡中。例如，外泌体或微泡包含选自多肽和多核苷酸(rna诸如mrna、mirna和非编码rna和dna)中的至少一种生物分子。例如，凋亡小体包括选自由破碎的细胞核和细胞器组成的组中的至少一种。细胞外囊泡优选包含选自多肽和多核苷酸中的至少一种生物分子。更优选地，细胞外囊泡包含选自多肽和多核苷酸中的至少一种生物分子。本文中，多肽是指多个氨基酸通过肽键结合而成的化合物，并包括具有相对大的分子量的蛋白质和相对小的分子量的肽。
35.淀粉样蛋白β前体样蛋白1：aplp1是淀粉样蛋白前体蛋白基因家族的成员之一，aplp1蛋白在脑内表达，是类似于淀粉样蛋白βa4前体的切割蛋白质的被分泌酶裂解的膜结合糖蛋白。可作为转录激活因子的细胞内细胞质片段通过这种切割被释放。人类aplp1已，例如，以基因id：333注册。ncbi参考序列为，例如，nm_001024807.3。对于人aplp1，已经报道了两种变体，但是在本实施方式中，变体的类型不受限制。
36.神经系统细胞可以包括神经细胞和神经胶质细胞。神经胶质细胞可以包括星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞。
37.样品包含从含有细胞外囊泡的试样中粗略纯化的细胞外囊泡。样品可以是细胞外囊泡的分散体或细胞外囊泡的小球。
38.从试样中粗纯化细胞外囊泡的方法是已知的，例如，细胞外囊泡可以通过尺寸排阻色谱、超速离心、亲和纯化、聚合物沉淀或其组合进行粗纯化。这些粗纯化方法可以使用已知的方法。尺寸排阻色谱不受限制，只要细胞外囊泡可以按大小分级。例如，可以使用细胞外囊泡分离试剂盒qev(izon science)等进行尺寸排阻色谱。在超速离心的情况下，例如，可以通过以100,000g至150,000g超速离心约2至3小时来获得细胞外囊泡。优选地，根据需要，在进行超速离心时，优选用pbs、hepes缓冲液、细胞培养基等稀释试样，使得比重变为约1.000至1.010。亲和纯化可以包括，例如，磷脂酰丝氨酸亲和纯化、cd63亲和纯化、阴离子亲和纯化等。聚合物沉淀是使用聚醚诸如聚乙二醇、聚丙二醇或聚丁二醇沉淀细胞外囊泡的方法。细胞外囊泡的粗纯化优选通过能够获得大小为约70nm至1000nm的细胞外囊泡的方法进行。
39.试样取自动物的活体，优选诸如人、小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、马等哺乳动物，只要其含有细胞外囊泡即不受限制。例如，试样包括全血、血清、血浆、淋巴、尿液、腹水、胸腔积液、脑脊液、细胞间液、眼泪、鼻涕、唾液等。
40.抗-aplp1抗体只要其可以结合aplp1蛋白的至少一部分即不受限制。另外，抗-aplp1抗体可以是一种类型，也可以是多种类型的混合物。作为“抗体”，可以使用多克隆抗体、单克隆抗体及其片段(例如fab、f(ab')、f(ab)2等)中的任一种。免疫球蛋白的种类和亚类没有特别限制。此外，抗体可以是从抗体文库中筛选的抗体，诸如嵌合抗体、scfv等。例如，r&dsystems af3129可用作抗-aplp1抗体。
41.抗体不需要被纯化，可以是含有抗体的抗血清、腹水、从这些中分离的免疫球蛋白级分等。
42.此外，抗体可以与载体结合。载体的实例包括用于免疫沉淀的已知载体。例如，载体为磁珠、琼脂糖珠、纤维素珠、微孔板、管等。
43.混合抗-aplp1抗体和含有细胞外囊泡的样品只要在抗-aplp1抗体可以与细胞外囊泡中存在的aplp1结合的条件下进行混合即不受限制。作为实例，可以包括ph为约6至9的tris-hcl缓冲液、磷酸缓冲液、hepes缓冲液、马来酸缓冲液、chaps缓冲液等。优选将与盐水相同的量的氯化钠添加到这些缓冲液中。此外，可以添加牛血清白蛋白、脱脂牛奶等作为封闭试剂。反应温度为约4℃至37℃。此外，抗体与细胞外囊泡之间反应优选在搅拌下进行。反应时间取决于反应温度，但当反应温度为约4℃时为约4小时至48小时左右，当反应温度为约37℃时为约0.5小时至4小时。
44.通过上述反应，抗-aplp1抗体与细胞外囊泡结合，形成抗-aplp1抗体与细胞外囊泡的复合物(也称为“抗-aplp1抗体-细胞外囊泡复合物”)。
45.可以通过已知的方法进行收集抗-aplp1抗体-细胞外囊泡复合物。当抗-aplp1抗体预先与载体结合时，可以根据载体的性质选择收集方法。例如，当载体是磁珠时，抗-aplp1抗体-细胞外囊泡复合物可以被吸附在磁体上并被收集。当载体为诸如琼脂糖珠或纤维素珠等的非磁性珠时，可通过离心收集抗-aplp1抗体-细胞外囊泡复合物。
46.当抗-aplp1抗体预先未与载体结合时，与对所用抗体具有亲和性的物质结合的载体，例如与抗-aplp1抗体、蛋白a或蛋白g结合的二抗，可以用于收集抗-aplp1抗体-细胞外囊泡复合物。收集载体和与载体结合的抗-aplp1抗体-细胞外囊泡复合物的方法与预先与载体结合的抗-aplp1抗体相同。
47.在收集抗-aplp1抗体-细胞外囊泡复合物的过程中，可以包括洗涤抗-aplp1抗体-细胞外囊泡复合物以进行b(结合)/f(游离)分离的步骤，其中可以适当去除未与抗-aplp1反应的细胞外囊泡和未与细胞外囊泡反应的抗-aplp1抗体。
48.由于aplp1是在神经系统细胞中特异性表达的蛋白质，因此可以通过上述收集方法收集源自神经系统细胞的细胞外囊泡。
49.2.检测神经精神障碍的方法
50.在本实施方式中，上述1中收集的细胞外囊泡用于检测神经精神障碍。
51.检测神经精神障碍的方法包括从上述1中收集的细胞外囊泡中获取神经精神障碍生物标志物的多肽和/或多核苷酸的测量值，并将该测量值与相应的参考值进行比较以确定该测量值是否在参考范围之内或在参考范围之外。当测量值在参考范围之外时，可以确定采集试样的受试者患有神经精神障碍。或者，如果测量值在参考范围内，则可以确定采集试样的受试者未患有神经精神障碍。
52.此外，可以通过确定测量值与参考值分离的程度来确定神经精神障碍的严重程度。
53.神经精神障碍可以包括精神障碍和神经系统疾病。神经系统疾病可以包括神经退行性疾病、脑脊髓外伤后神经功能障碍、脑肿瘤、感染相关的脑脊髓疾病、多发性硬化症等。神经退行性疾病可包括痴呆、帕金森病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、进行性核上性麻痹、多系统萎缩症、三联体重复序列疾病等。痴呆可包括阿尔茨海默病、老年性痴呆、路易体病、额颞叶痴呆、血管性痴呆、酒精相关性痴呆和皮质基底节变性。感染相关的脑脊髓疾病可包括脑膜炎、脑脓肿、克雅氏病和aids痴呆。脑肿瘤可以包括星形细胞瘤。
54.精神障碍可以包括精神分裂症、抑郁症、躁郁症等。
55.例如，细胞外囊泡中含有的tau蛋白，特别是磷酸化的tau蛋白，是阿尔茨海默病的生物标志物。当取自受试者的试样中tau蛋白或磷酸化tau蛋白的测量值高于参考值时，可以确定受试者患有阿尔茨海默病。
56.作为每种疾病中报告的生物标志物，可以包括针对帕金森病和路易体痴呆的α-突触核蛋白；针对肌萎缩性脊髓侧索硬化症和额颞叶痴呆的tar dna结合蛋白(tdp-43)；针对creutzfeldt-jakob疾病；神经丝轻链用于脑脊髓外伤后神经功能障碍、多发性硬化、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、进行性核上性麻痹、多系统萎缩症、三联体重复序列疾病、阿尔茨海默病、路易体病、额颞叶痴呆、血管性痴呆、皮质基底节变性等的异常朊病毒蛋白。此外，可以包括针对抑郁症的胰岛素样生长因子(igf-1)和脑源性神经营养因子(bdnf)；针对精神分裂症的microrna hsa-mir-34a、microrna hsa-mir-432；针对躁郁症的igf-1、bdnf等。
57.检测包含在细胞外囊泡中的多肽或多核苷酸形式的神经精神障碍的生物标志物。多核苷酸可以是rna或dna，除了mrna之外，rna可以包括microrna、ncrna等。针对神经精神障碍的生物标志物的多肽和/或多核苷酸可以包括它们的片段以及全长。
58.检测针对神经精神障碍的多肽形式的生物标志物的方法可以包括已知的方法，例如western印迹法、酶联免疫吸附试验(elisa)等。另外，检测针对神经精神障碍的rna形式的生物标志物的方法可以包括rt-pcr(包括定量rt-pcr)、微阵列、rna-seq等已知的方法。检测针对神经精神障碍的dna形式的生物标志物的方法可以包括已知的方法，诸如pcr(包括定量pcr)、微阵列、测序等。
59.当通过western印迹法、elisa等检测针对神经精神障碍的多肽形式的生物标志物时，用预定的裂解缓冲液裂解细胞外囊泡作为预处理。用裂解缓冲液裂解的样品用作测试样品。
60.通过western印迹法、elisa等检测神经精神障碍的生物标志物的一抗不受限制，只要能够检测神经精神障碍的生物标志物即可。
61.当通过rt-pcr、微阵列、rna-seq等检测针对神经精神障碍的rna形式的生物标志物时，从细胞外囊泡中提取rna作为预处理。此外，如果需要，可以将提取的rna用作逆转录模板以合成互补dna(cdna)。rna或cdna可用于检测生物标志物。
62.作为用于rt-pcr的引物(在定量rt-pcr的情况下，可以包括探针)，可以使用市售的引物。此外，也可以使用市售的微阵列。
63.对于rna-seq，可以使用下一代测序仪(例如，由illumina制造的)等来获得针对神经精神障碍的生物标志物的mrna的读数。
64.当通过pcr、微阵列、测序等检测针对神经精神障碍的dna形式的生物标志物时，从细胞外囊泡中提取dna作为预处理。此外，如果需要，可以使用提取的dna作为模板进行扩增反应。从细胞外囊泡中提取的dna或扩增的dna可用于检测生物标志物。
65.作为用于pcr的引物(在定量pcr的情况下，可以包括探针)，可以使用市售的引物。此外，也可以使用市售的微阵列。
66.对于测序，可以使用下一代测序仪(例如，由illumina制造的)等来获得与针对神经精神障碍的生物标志物相关的dna的读数。
67.当通过western印迹法、elisa、rt-pcr、pcr、rna-seq、测序、微阵列等检测针对神
经精神障碍的生物标志物时，如果在细胞外囊泡中检测针对神经精神障碍的生物标志物，则可以确定“检测到针对神经精神障碍的生物标志物”或“针对神经精神障碍的生物标志物的表达为阳性”。或者，当比较源自受试者的细胞外囊泡的针对神经精神障碍的生物标志物的多肽的量和源自健康个体的细胞外囊泡的针对神经精神障碍的生物标志物的多肽的量时，或比较源自受试者的细胞外囊泡的针对神经精神障碍的生物标志物的多核苷酸量与源自健康个体的细胞外囊泡的针对神经精神障碍的生物标志物的多核苷酸量时，如果取自受试者的测试样本中的针对神经精神障碍的生物标志物的多肽量或针对神经精神障碍的生物标志物的多核苷酸量高于取自健康个体的细胞外囊泡中的针对神经精神障碍的生物标志物的多肽量或针对神经精神障碍的生物标志物的多核苷酸量，可以确定为“检测到针对神经精神障碍的生物标志物”或“针对神经精神障碍的生物标志物的表达为阳性”。此外，如果取自受试者的细胞外囊泡中的针对神经精神障碍的生物标志物的多肽量或针对神经精神障碍的生物标志物的多核苷酸量与取自健康个体的针对神经精神障碍的生物标志物的多肽量或针对神经精神障碍的生物标志物的多核苷酸量为相同程度，可以确定“未检测到针对神经精神障碍的生物标记”或“针对神经精神障碍的生物标记的表达为阴性”。本文中，“为较高的值”的表述可以例示为该值表示1.2倍以上、优选1.5倍以上、更优选2倍以上、进一步优选5倍以上的值的情况。“相同程度”的表述可以示例为该值显示约0.8倍至小于1.2倍的值的情况。此外，在比较受试者和健康个体中针对神经精神障碍的生物标志物的多肽量或受试者和健康个体中针对神经精神障碍的生物标志物的多核苷酸的量之前，从每个试样纯化的细胞外囊泡的数量可以通过作为针对细胞外囊泡的标志物的cd9、cd63、cd81等多肽的量进行标准化。另外，可以通过由纳米颗粒追踪分析法等测定的颗粒数来进行细胞外囊泡的数量的标准化。多肽的量可以用质量或浓度表示，也可以用底物的发光强度等表示。多核苷酸的量可以是多核苷酸的拷贝数或读取数，可以用荧光强度等来表示。
68.作为另一实施方式，预先确定针对神经精神障碍的生物标志物的多肽或rna的量的参考值，如果源自受试者的细胞外囊泡中的针对神经精神障碍的生物标志物的多肽或rna的量在参考范围之外，可以确定“检测到针对神经精神障碍的生物标志物”或“针对神经精神障碍的生物标志物的表达为阳性”。此外，如果源自受试者的细胞外囊泡中的针对神经精神障碍的生物标志物的多肽或rna的量在参考范围内，则可以确定“未检测到针对神经精神障碍的生物标志物”或“针对神经精神障碍的生物标志物的表达为阴性”。参考值只要其可以确定是否检测到针对神经精神障碍的生物标志物的多肽的量或针对神经精神障碍的生物标志物的多核苷酸的量或针对神经精神障碍的生物标志物的表达是否为阳性即不受限制。并且可以通过已知的方法来确定。也可以通过roc(接收器操作特性曲线)曲线、判别分析法、模态法、kittler法、3σ法、p-tile法等确定可以确定是否检测到针对神经精神障碍的生物标志物的多肽量或针对神经精神障碍的生物标志物的多核苷酸的量或针对神经精神障碍的生物标志物的表达是否为阳性的值。此外，作为参考值，可以列举灵敏度、特异性、阴性预测值、阳性预测值、第一四分位数等。
69.3.收集源自神经系统细胞的成分的方法
70.在本实施方式中，上述1中收集的细胞外囊泡用于收集源自神经系统细胞的成分。
71.收集源自神经系统细胞的成分的方法包括从上述1中收集的细胞外囊泡中收集选自由糖、脂质、多肽和多核苷酸中的至少一种生物分子的步骤。
72.糖可以包括单糖、二糖、寡糖和多糖。此外，糖可以与脂质、蛋白质等结合。从细胞外囊泡中收集糖可以通过已知的方法使用负载酰肼/氧胺的聚合物、外源凝集素等来进行。
73.脂质可以包括脂肪酸、类花生酸、三酰基甘油、蜡酯、磷脂、鞘脂、类异戊二烯、脂蛋白等。可以使用folch法、脂质提取试剂盒(lipid extraction kit：cell biolabs，inc.)等进行从细胞外囊泡中提取脂质。
74.多肽和多核苷酸还可以含有上述2中描述的生物标志物和除上述生物标志物以外的成分。生物标志物的描述通过引用并入本文。
75.可以根据已知方法进行收集多肽和多核苷酸的步骤。此外，可以使用市售的提取试剂盒。
76.4.检测试剂
77.在该部分，描述了收集细胞外囊泡的检测试剂。检测试剂包含至少抗-aplp1抗体。抗-aplp1抗体的描述通过引用上述1中的描述并入本文。
78.检测试剂中所含的抗-aplp1抗体可以是一种，也可以是两种以上。
79.包含在检测试剂中的抗-aplp1抗体可以处于干燥状态或可以溶解在缓冲液，例如，磷酸盐缓冲盐水中。进一步地，检测试剂可以包括稳定剂，诸如β-巯基乙醇和dtt；保护剂，诸如白蛋白；表面活性剂，诸如聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯、聚氧乙烯(10)辛基苯基醚；防腐剂，诸如叠氮化钠中的至少一种。
80.抗-aplp1抗体可以用酶或荧光染料标记。结合亲脂素的抗体可以固定在微孔板、磁珠等上。
81.5.测试试剂盒
82.在该部分中，对包含上述4所述的收集细胞外囊泡的检测试剂的试剂盒进行说明。
83.可以提供包括描述检测试剂和如何使用该试剂的包装插页或者描述描述如何使用该试剂的网页的url的包装插页的测试试剂盒形式的测试试剂盒。此外，当抗-aplp1抗体不与载体或固相结合时，可以包括用于将抗-aplp1抗体与载体或固相结合的二抗偶联珠、蛋白a珠、蛋白g珠、二抗固定微孔板、蛋白a固定微孔板、蛋白g固定微孔板、二抗固定管等。
84.进一步地，试剂盒可以包括用于尺寸排阻色谱的柱、用于亲和纯化的柱、用于粗纯化细胞外囊泡的聚醚诸如聚乙二醇等。
85.此外，它可以包含用于检测存在于细胞外囊泡中的神经精神障碍的生物标志物的抗体、探针、引物等。
86.实施例
87.在下文中，将参考实施例更加详细地描述本实施方式，但本发明不被解释为限于这些实施例。
88.1.实施例1：通过使用抗-aplp1抗体从血浆中收集源自神经系统细胞的细胞外囊泡。
89.(一)试样
90.使用edta-2k管从患者收集血液，并分离出20ml血浆。血浆储存在-80℃下直至测试。使用时，解冻血浆，以2500g、4℃离心10分钟，收集上清液。
91.(ii)血浆中的细胞外囊泡的粗纯化
92.根据附随的协议通过使用qev10(meiwafosis集团有限公司)从10ml血浆中收集
af3129)以制备结合了抗-aplp1抗体的磁珠。
109.(ii)在培养上清液中制备细胞外囊泡(ev)
110.将从ips细胞分化的神经细胞的培养上清液在2,500g下离心10分钟，将上清液以各12ml装入4个超速离心管中。在120,000g下超速离心2.5小时后，去除上清液并收集含有细胞外囊泡的小球。小球添加有12ml pbs，移液，并再次以120,000g超速离心2.5小时以收集小球。小球添加有25μl pbs，移液，并转移到1.5ml试管中。
111.(iii)免疫沉淀和western印迹法
112.将100μl与aplp1抗体偶联的置于螺旋盖管中。添加20μl超速离心制备的ev、80μl
×
10complete(roche)和600μl pbs，在4℃下孵育混合物4小时，同时旋转并混合。将试管旋下，连接到磁性支架上，静置1分钟。将上清液转移到另一管中，将800μl pbs添加到珠中，上下摇动管。将试管旋下，连接到磁性支架上，静置1分钟。除去上清液后，向装有磁珠的试管中添加12μl
×
2的western印迹法用样品缓冲液，涡旋后在97℃下加热混合物5分钟。离心后，连接在磁力架上静置1分钟，在5％～20％或15％sds-page凝胶上电泳10μl。在另一管中取20μl免疫沉淀后的上清液，添加4μl
×
6样品缓冲液，涡旋后在97℃下加热5分钟。离心后，在5％～20％或15％sds-page凝胶上将20μl以120v电压电泳100分钟。
113.通过湿转移(400ma，1小时)将电泳后的凝胶转移到pvdf膜上。印迹后的膜用2％ecl prime封闭试剂封闭2小时。
114.随后，膜添加有分别用2％ecl prime封闭剂稀释10,000倍的aplp1c-末端抗体(calbiochem 171615)、稀释1,000倍的l1cam抗体(santa cruz sc-53386)、稀释2,000倍的cd63抗体(santa cruz sc-5275)、稀释1,000倍的flotillin-1抗体(bd transduction 610820)和稀释1,000倍的snap25抗体(abcam ab5666)，并在4℃振荡孵育过夜。孵育后，用0.1％tbs-t在5分钟内洗涤膜6次。
115.分别与l1cam、cd63和flotillin-1反应的膜添加有作为二抗的用2％ecl prime封闭剂稀释10,000倍的抗小鼠igg-hrp(promega w402b)，室温振荡孵育1小时。分别与aplp1和snap25反应的膜添加有作为二抗的用2％ecl prime封闭试剂稀释10,000倍的抗兔igg-hrp(promega w401b)，并在室温振荡孵育1小时。孵育后，用0.1％tbs-t在5分钟内洗涤膜6次。
116.ld(wako)的溶液a和溶液b以各800μl的量混合，膜被浸渍并静置5分钟。通过myecl imager(thermo fisher scientific)检测信号(10至300秒)。
117.(iv)结果
118.western印迹法的结果如图2所示。
119.泳道1为1μg ips神经元裂解物，泳道2为免疫沉淀前的ev，泳道3为输入，泳道4为ev免疫沉淀后的上清液，泳道5为ev免疫沉淀后的抗体偶联珠。电泳的输入和上清液的量是全部的四十分之一。
120.在抗体珠中检测到aplp1、ev标记蛋白(cd63、flotillin-1)和神经来源蛋白(l1cam、snap25)。由此发现，通过使用抗-aplp1抗体可以收集细胞外囊泡。