【技术领域】
本发明涉及动物摄食量研究技术领域，具体涉及一种测定沉积食性小型底栖动物摄食量的方法。
背景技术：
底栖动物(zoobenthos)是指生活史的全部或大部分时间生活于水体底部的水生动物群，除定居和活动生活的以外，栖息的形式多为固着于岩石等坚硬的基体上和埋没于泥沙等松软的基底中。此外，还有附着于植物或其他底栖动物体表的，以及栖息在潮间带的底栖种类。在摄食方法上，以悬浮物摄食和沉积物摄食居多。多为无脊椎动物，是一个庞杂的生态类群。按其尺寸，分大型底栖动物、小型底栖动物，其所包括的种类及其生活方式较浮游动物复杂得多，常见的底栖动物有软体动物门的腹足纲的螺和瓣鳃纲的蚌、河蚬等；环节动物门寡毛纲的水丝蚓、尾鳃蚓等，蛭纲的舌蛭、泽蛭等，多毛纲的沙蚕；节肢动物门昆虫纲的摇蚊幼虫、蜻蜓幼虫、蜉蝣目稚虫等，甲壳纲的虾、蟹等；扁形动物门涡虫纲等。
多数底栖动物长期生活在底泥中，具有区域性强，迁移能力弱等特点，对于环境污染及变化通常少有回避能力，其群落的破坏和重建需要相对较长的时间；且多数种类个体较大，易于辨认；同时，不同种类底栖动物对环境条件的适应性及对污染等不利因素的耐受力和敏感程度不同；根据上述特点，利用底栖动物的种群结构、优势种类、数量等参量可以确切反应水体的质量状况。
底栖动物按其尺寸，分大型底栖动物、小型底栖动物和微型底栖动物。按其生活方式，分固着型、底埋型、钻蚀型、底栖型和自由移动型。固着型是固着在水底或水中物体上生活的动物，如海绵动物、腔肠动物、管栖多毛类、苔藓动物等；底埋型是埋在水底泥中生活的动物，如大部分多毛类、双壳类的蛤和蚌、穴居的蟹、棘皮动物的海蛇尾等；钻蚀型是钻入木石、土岸或水生植物茎叶中生活的动物，如软体动物的海笋、船蛆和甲壳类的蛀木水虱；底栖型是在水底土壤表面生活、稍能活动的动物，如腹足类软体动物、海胆、海参和海星等棘皮动物；自由移动型是在水底爬行或在水层游泳一段时间的动物，如水生昆虫、虾、蟹等。多数底栖动物长期生活在底泥中，具有区域性强，迁移能力弱等特点，对于环境污染和变化通常少有回避能力，其群落的破坏和重建需要相对较长的时问；多数种类个体较大，易于辨认；不同种类底栖动物对环境条件的适应性和对污染等不利因素的耐受力和敏感程度不同。根据上述特点，利用底栖动物的种群结构、优势种类、数量等参数可以反映水体的质量状况。
目前，已有对于生物摄食量的研究，例如文献cn201210274477一种测定鱼类个体摄食量的方法，针对测定鱼类个体摄食量的现有技术中存在的放射性危害、操作不便、不易混匀、误差较大、影响鱼类摄食等缺点，提供一种测定鱼类个体摄食量的方法，具体方案为：把筛分成直径约为0.25mm的金属颗粒与常规饲料按一定比例搅拌混合制成含金属颗粒的饲料，然后投喂实验鱼，饲料被胃肠道吸收后用x光机检测鱼体，以金属颗粒的数量间接测定鱼类摄食量。该文献研究了鱼类个体的摄食量，其结论不一定适用于对于小型底栖动物(表面和埋栖)的摄食量的研究。
以沉积物为食的小型底栖动物(表面和埋栖)的摄食量测定在生态学研究中具有重要意义，是为该类动物生理生态学研究以及其栖息地生源要素生物地球化学循环研究提供基础数据的研究内容之一。由于沉积食性底栖动物的食物来源和粪便排泄均在沉积物表面或沉积物内部，因而造成食物、沉积物、粪便的混合，难以用常用的分离方法分离定量，因此没有发展出有效的摄食量测定方法。尽管采用生物化学和分子生物学方法已经可以对沉积食性的底栖动物食物来源和组成进行鉴定和定性研究，但还不能对其摄食量进行准确定量。
因此，开展对于沉积食性小型底栖动物摄食量的研究很有必要。
技术实现要素：
针对现有在生态学研究中难以对小型沉积食性底栖动物摄食量进行测定的问题，本发明提供了一种测定沉积食性小型底栖动物摄食量的方法，采用了基于水体颗粒有机碳含量测定的摄食量测定方法，由于沉积食性动物的食性以颗粒有机碳的形式被摄食，消化残渣排出体外后也成为悬浮或沉积颗粒有机物，因此根据其生活环境中颗粒有机碳的数量变化来计算某一时间段内的有机碳摄食量；在预先测定食物有机碳、蛋白质、脂肪、能量等营养成分含量的基础上，通过将有机碳摄食量乘以食物不同营养成分含量与有机碳含量的比值，从而换算为不同营养成分的摄食量。
一种测定沉积食性小型底栖动物摄食量的方法，包括如下步骤：
1)养殖装置：根据底栖动物的习性，在适宜大小水体的玻璃容器中，选择适宜粒径的石英砂作为沉积物，根据底栖动物活动习性铺设一定厚度的石英砂，作为底栖动物驯养和实验装置；
2)底栖动物排放颗粒有机碳的测定：将一定生物量的底栖动物放入未放养过底栖动物的步骤1)所述的养殖装置中，在24小时后，将养殖装置颠倒混匀，然后定量量取养殖装置内水体，并取定量石英砂，测定水体和石英砂中颗粒有机碳含量，根据养殖装置内颗粒有机碳增加量计算24小时内底栖动物排放颗粒有机碳量；
3)底栖动物摄食颗粒有机碳的测定：在养殖装置中加入定量食物，混匀到养殖装置水体中，然后放入一定生物量的底栖动物，在24小时后，将养殖装置颠倒混匀，然后定量量取养殖装置内水体，并取定量石英砂，测定水体和石英砂中颗粒有机碳含量，根据养殖装置内颗粒有机碳的减少量计算24小时内底栖动物的有机碳摄食量。
本发明所述的一种测定沉积食性小型底栖动物摄食量的方法，具体包括如下步骤：
1)养殖装置：根据底栖动物生物量和生活习性，选择适宜大小的玻璃容器，作为测定用养殖容器；
2)底质：根据拟测定的底栖动物的生活习性，选择适宜粒径的石英砂作为底质，并根据底栖动物的钻潜深度，按钻潜深度的1.5倍确定容器内铺设石英砂的厚度，并称量加入的石英砂重量(w)；
3)食物准备：将拟投喂的食物在70℃下烘干至恒重，用电动粉碎机粉碎，过60目筛后备用，用toc测定仪测定食物有机碳含量(tocf)，并测定食物蛋白质(prof)、脂肪(lipf)、能量(enrf)营养成分含量，计算营养成分与有机碳的比值关系；
4)玻璃纤维滤膜的预处理：将0.45μm玻璃纤维滤膜用马弗炉在800℃下保持10小时，除去滤膜可能带有的有机碳，冷却后密封保存待用；
5)驯养：将一定生物量的底栖动物放入养殖装置中，加入适宜体积(v)的水，按设计的投喂量和投喂方式驯养底栖动物10天；
6)空白对照：在养殖装置中按上步骤的驯养相同的投喂量和投喂方式加入定量食物(i，g)，混匀到养殖装置水体中，不放底栖动物作为空白对照实验，空白对照实验设3-5个重复；在24小时后，将养殖装置颠倒混匀，然后量取养殖装置内水体100毫升，用经预处理的玻璃纤维滤膜过滤后，将滤膜在烘箱中70℃烘干至恒重，用toc测定仪测定有机碳含量；底质石英砂取100-150克样品，在烘箱中70℃烘干至恒重，用toc测定仪测定有机碳含量，根据养殖装置内颗粒有机碳的变化计算24小时内食物在养殖装置内的有机碳总量变化比例，作为计算摄食量的校正因子(f)；
7)粪便排泄颗粒有机碳测定：按驯养密度将一定生物量的底栖动物放入未放养过底栖动物的养殖装置中，不投喂食物，粪便排泄颗粒有机碳测定实验设10-12个重复；在24小时后，将养殖装置颠倒混匀，然后量取装置内水体100毫升，用经预处理的玻璃纤维滤膜过滤后，将滤膜在烘箱中70℃烘干至恒重，用toc测定仪测定有机碳含量；底质石英砂取100-150克样品，在烘箱中70℃烘干至恒重，用toc测定仪测定有机碳含量，根据装置内颗粒有机碳增加量计算24小时内底栖动物排放颗粒有机碳量(fpoc，g)；
8)颗粒有机碳摄食量测定：在养殖装置中按驯养过程相同的投喂量和投喂方式加入定量食物(i，g)，混匀到养殖装置水体中，然后放入一定生物量(b，g)的底栖动物，颗粒有机碳摄食量测定实验设10-12个重复；在24小时后，将养殖装置颠倒混匀，然后量取养殖装置内水体100毫升，用经预处理的玻璃纤维滤膜过滤后，将滤膜在烘箱中70℃烘干至恒重，用toc测定仪测定有机碳含量；底质石英砂取100-150克样品，在烘箱中70℃烘干至恒重，用toc测定仪测定有机碳含量；根据测定结果计算实验结束时养殖装置内的总颗粒有机碳量(epoc，g)，并根据养殖装置内颗粒有机碳的减少量计算24小时内底栖动物的颗粒有机碳摄食量(cpoc，g)；
9)数据计算：
①校正因子(f)的计算
f＝空白对照装置24小时后总有机碳量/投入食物总有机碳量
②粪便排泄颗粒有机碳量(fpoc，g)计算
fpoc＝不投喂食物装置水体颗粒有机碳量+沉积物有机碳量
③实验装置实验结束有机碳总量计算
epoc＝实验装置水体颗粒有机碳量+沉积物有机碳量
④颗粒有机碳摄食量(cpoc，g)的计算
cpoc＝i×tocf-(epoc-fpoc)/f
⑤摄入营养成分的定量计算(以能量摄食量(cenergy，j)为例)
cenergy＝cpoc×(enrf/tocf)
公式中cenergy、enrf、tocf分别为能量摄食量、食物能量含量、食物有机碳含量。
本发明中：
步骤1)所述的适宜大小的玻璃容器，是规格为50×40×40cm3的水族箱或玻璃缸。
步骤2)所述的适宜粒径的石英砂，是指0.10-0.25mm粒径的石英砂。
步骤2)所述的石英砂的厚度，是10cm。
步骤5)所述的一定生物量，是按照平均体重为0.5g的方格星虫中培苗15条放入50×40×40cm3的水族箱中的比例。
步骤5)所述的加入适宜体积的水，是加入相当于养殖装置80％体积的水。
步骤6)所述的一定生物量，是按照平均体重为0.5g的方格星虫中培苗15条放入50×40×40cm3的水族箱中的比例。
和现有技术相比，本发明具有如下优点：
1、本发明所述的一种测定沉积食性小型底栖动物摄食量的方法能够准确计算沉积食性底栖动物的摄食量。
2、本发明所述的一种测定沉积食性小型底栖动物摄食量的方法可根据饵料营养成分与有机碳含量的比值计算不同营养成分的摄入量；
3、本发明所述的一种测定沉积食性小型底栖动物摄食量的方法可适用于多种小型沉积食性底栖动物摄食量测定。
【具体实施方式】
以下结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步说明。
实施例
一种测定沉积食性小型底栖动物摄食量的方法，包括如下步骤：
1材料与方法
1.1格星虫苗种
实验用方格星虫苗种为广西海洋研究所繁育的方格星虫苗种，在中培塘经过4个月左右的中培，规格达到约0.5g/ind后，从中培塘挖捕收集，经24h清水养殖吐沙后挑选外观无损伤、活力较好、规格整齐的苗种待用；
1.2饲料
实验用4种饲料原料分别为红树叶、浒苔、大米草、对虾饲料；红树叶为在海滩收集的树叶，带回实验室用清水冲洗除去泥沙，然后用蒸馏水洗净，控水后在70℃下烘干至恒重，然后用电动粉碎机粉碎，过60目筛后备用；浒苔为在海滩收集的浒苔，处理方法与红树叶相同；大米草为在滩涂收集的大米草枯叶和茎混合物，带回实验室后处理方法和红树叶相同；对虾饲料则为市场采购的5个品牌的对虾饲料，按等量比例混合后，在70℃下烘干至恒重，然后用电动粉碎机粉碎，过60目筛后备用；
1.3实验条件
实验在室内车间进行；养殖所用水族箱规格为为50×40×40cm3，底部铺沙10cm，水深为高出沉积物10cm；实验车间物控温摄食，光照为半透明棚顶透射自然光，光照周期与自然光照周期一致；水族箱连续充空气；实验期间海水盐度范围为25～30，ph值范围为8.0～8.3，水温在冬天最低为10℃，最高为7月份达到32℃；
1.4实验设计
1.4.1驯化实验
每种饲料使用5个水族箱设5个平行，共使用20个水族箱进行养殖；每个水族箱放入平均体重为0.5g的方格星虫中培苗15条，称重得到初始体重(iw，g)；水族箱使用完全随机化处理安排不同饲料处理；
1.4.2粪便排泄颗粒有机碳与校正因子测定
按驯养密度将一定生物量的底栖动物放入未放养过底栖动物的锥形瓶中，容量为5l，底部铺10cm厚的粒径为0.10-0.25mm的石英砂，不投喂食物，粪便排泄颗粒有机碳测定实验设10个重复；在24小时后，将装置颠倒混匀，然后量取装置内水体100毫升，用经预处理的玻璃纤维滤膜过滤后，将滤膜在烘箱中70℃烘干至恒重，用toc测定仪测定有机碳含量；底质石英砂取100克样品，在烘箱中70℃烘干至恒重，用toc测定仪测定有机碳含量；根据装置内颗粒有机碳增加量计算24小时内底栖动物排放颗粒有机碳量(fpoc，g)；
每次实验按驯养过程相同的投喂量和投喂方式加入定量食物(i，g)，混匀到装置水体中，不放底栖动物作为对照实验，对照实验设3个重复；在24小时后，将装置颠倒混匀，然后量取装置内水体100毫升，用经预处理的玻璃纤维滤膜过滤后，将滤膜在烘箱中70℃烘干至恒重，用toc测定仪测定有机碳含量；底质石英砂取100克样品，在烘箱中70℃烘干至恒重，用toc测定仪测定有机碳含量；根据装置内颗粒有机碳的变化计算24小时内食物在装置内的有机碳总量变化比例，作为计算摄食量的校正因子(f)；
1.4.3摄食量测定实验
养殖实验期间，每个月进行一次能量代谢实验，实验期间共进行7次；将用不同饲料养殖的方格星虫用密封的锥形瓶测定其24h的摄食量；锥形瓶容量为5l，底部铺5cm厚的粒径为0.5mm的石英砂，在预实验的基础上，每个锥形瓶放入4条方格星虫，设置6个重复，3个不放方格星虫的对照瓶进行实验；首先将5g饲料放入50l海水中，充气使其分布均匀，然后灌入实验和对照锥形瓶中，用保鲜膜封口，同时取水样3份，用0.45μm玻璃纤维滤膜过滤3份100ml水样，滤膜保存测定toc含量；24小时后，将每个锥形瓶颠倒15次混匀水体后，分别取水样和石英砂处理测定toc含量；根据测定结果计算实验结束时装置内的总颗粒有机碳量(epoc，g)，并根据装置内颗粒有机碳的减少量计算24小时内底栖动物的颗粒有机碳摄食量(cpoc，g)；
1.5样品成分测定
将拟投喂的食物在70℃下烘干至恒重，然后用电动粉碎机粉碎，过60目筛后备用，用toc测定仪测定食物有机碳含量(tocf)，并测定食物蛋白质(prof)、脂肪(lipf)、能量(enrf)等营养成分含量，计算营养成分与有机碳的比值关系；其中toc和tn用元素分析仪测定，能量含量用氧弹式热量计测定；滤膜和石英砂的toc和tn含量用元素分析仪测定；
1.6数据计算
1.6.1校正因子(f)的计算
f＝空白对照装置24小时后总有机碳量/投入食物总有机碳量
1.6.2粪便排泄颗粒有机碳量(fpoc，g)计算
fpoc＝不投喂食物装置水体颗粒有机碳量+沉积物有机碳量
1.6.3实验装置实验结束有机碳总量计算
epoc＝实验装置水体颗粒有机碳量+沉积物有机碳量
1.6.4颗粒有机碳摄食量(cpoc，mg)的计算
cpoc＝i×tocf-(epoc-fpoc)/f
1.6.5摄食量(c，mg)计算
c＝cpoc/tocf
1.6.6摄食营养成分的定量计算
1.6.6.1能量摄食量(cenergy，j)
cenergy＝cpoc×(enrf/tocf)
公式中cenergy、enrf、tocf分别为能量摄食量、食物能量含量、食物有机碳含量；
1.6.6.2粗蛋白摄食量(cprotein，mg)
cenergy＝cpoc×(prof/tocf)
公式中prof、tocf分别为食物粗蛋白含量、食物有机碳含量，其中prof由食物的总氮含量(tn)乘以6.25得到；
1.7统计分析
对不同处理间的数据进行了单因素方差分析，duncan’s多重比较被用于检验不同处理间是否存在显著差异；在进行方差分析前，能量分配百分比例的数据进行了反正弦转换
2实验结果
2.1方格星虫的存活与生长
4种饵料的能量、有机碳、氮含量存在显著差异，见表1；
表1四种饵料的能量、有机碳和氮含量
注：同一行中没有相同上标字母的数值相互之间差异显著；
2.2方格星虫的摄食量
投喂4种饵料的方格星虫个体每天摄食量见表2，有机碳摄食量以对虾饲料为最高，摄食饵料重量和能量以条浒苔最大，粗蛋白摄食量以对虾饲料最多；
表2方格星虫对4种饵料的有机碳摄食量、摄食饵料重量、能量摄食量和粗蛋白摄食量
注：同一列中没有相同上标字母的数值相互之间差异显著。
3结果：
本发明所述的一种测定沉积食性小型底栖动物摄食量的方法能够准确计算方格星虫对不同饵料颗粒有机碳的摄食量，并根据不同饵料的营养指标与有机碳含量的比值，换算为不同营养成分的摄食量，对于开展需要测定方格星虫摄食量的生理生态学研究提供了极大便利。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。