改良凝胶电泳检测血清中低密度脂蛋白的方法与流程

1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及改良凝胶电泳检测血清中低密度脂蛋白的方法。


背景技术：

2.血浆脂蛋白是负责胆固醇、甘油三酯和磷脂运输的球形颗粒。脂蛋白可以分为五大类，包括乳糜微粒、极低密度脂蛋白(vldl)、中密度脂蛋白(idl)、低密度脂蛋白(ldl)和高密度脂蛋白(hdl)。其中ldl(low
‑
density lipoprotein)是一组由大小、密度、化学成分不同的亚组分颗粒组成的异质性脂蛋白,单个ldl颗粒的直径约为2.20
×
103
‑
2.75
×
103nm，通常运送3000至6000个脂肪分子/颗粒，其大小随颗粒内脂肪分子的数量而变化。目前，可以将ldl分离为7个ldl亚组分，分别命名为ldl
‑
1至ldl
‑
7，其中ldl
‑
1由最大的颗粒组成，ldl
‑
7由最小的颗粒组成。
3.ldl的亚组成和比例受基因，环境，遗传等影响，已知年龄、性别和脂质状态会影响ldl亚组分[7]。脂蛋白电泳谱主要由颗粒较大的ldl
‑
1和ldl
‑
2亚组分组成，称之为“a型”。除ldl
‑
1和ldl
‑
2之外，还包括ldl
‑
3至ldl
‑
7亚组分，该部分由颗粒较小、密度较大的脂蛋白组成，称为“b型”[austin ma,king mc,vranizan km,krauss rm.atherogenic lipoprotein phenotype.a proposed genetic marker for coronary heart disease risk.circulation 1990；82:495
–
506.]。研究表明[campos h,genest jj jr,blijlevens e,mcnamara jr,jenner jl,ordovas jm,et al.low density lipoprotein particle size and coronary artery disease.arterioscler thromb 1992；12:187
–
95.]，b型ldl与冠状动脉疾病(cad)的发生具有高的相关性【coresh j,kwiterovich po jr,smith hh,bachorik ps.association of plasma triglyceride concentration and ldl particle diameter,density,and chemical composition with premature coronary artery disease in men and women.j lipid res 1993；34:1687
–
97.】，而与性别、年龄和体重无关，因此低高密度脂蛋白是一个能够预测冠状动脉疾病(cad)的指标[gardner cd,fortmann sp,krauss rm.association of small low
‑
density lipoprotein particles with the incidence of coronary artery disease in men and women.jama1996；276:875
–
81.]，血清中高浓度的低密度脂蛋白被认为是形成冠心病的主要因素。当ldl颗粒被氧化时，就会增加患心血管疾病的风险，这主要因为氧化形式的ldl更容易被血管壁上蛋白聚糖所截留，并产生一系列复杂的生化调节反应，随着时间的推移，ldl颗粒浓度的逐渐增加，将导致动脉粥样硬化【陈华新主编.冠心病防治一本通.北京：金盾出版社，2012：31】。
[0004]
脂蛋白的分析方法有密度梯度超离心化[griffin ba,caslake mj,yip b,tait gw,packard cj,shepherd j.rapid isolation of low density lipoprotein(ldl)subfractions from plasma by density gradient ultracentrifugation.atherosclerosis 1990；83(1):59
‑
67]，该方法是金标准【nehemias mun～iz.measurement of plasma lipoproteins by electrophoresis on polyacrylamide gel.clin.chem.1977:23/10,
1826
‑
1833】，但该方法需要超离设备，而且操作时间长，不能进行大批量进行检测。核磁共振(nmr)[otvos jd.measurement of lipoprotein subclass profiles by nuclear magnetic resonance spectroscopy.in:handbook of lipoprotein testing,rifai n,warnick gr,dominiczak mh,eds.aacc press,1999,2nd edition,washington,dc.pages 609
‑
623.]自1991年就已用来检测血浆中的脂蛋白【otvos jd,jeyarajah ej,bennett dw.quantification of plasma lipoproteins by proton nuclear magnetic resonance spectroscopy.clin chem 1991；37:377
–
86.】。血浆中不同大小的vldl、ldl、hdl亚型同时发出不同的nmr信号，其单次振幅可准确、可重复测量；所测得的亚类信号振幅与发出信号的亚类粒子的数目成正比，而与颗粒脂质组成的变化无关【jeyarajah ej1,cromwell wc,otvos jd.lipoprotein particle analysis by nuclear magnetic resonance spectroscopy.clin lab med.2006dec；26(4):847
‑
70】,该方法同样需要贵重的仪器设备，操作时间长以及不能够高通量的进行检测，而且对操作人员要求高。凝胶电泳方法是目前最常用的检测方式【shaina v.hirany,yusra othman,patricia kutscher,david l.rainwater,ishwarlal jialal and sridevi devaraj.comparison of low
‑
density lipoprotein size by polyacrylamide tube gel electrophoresis and polyacrylamide gradient gel electrophoresis.am j clin pathol 2003；119:439
‑
445】，应用苏丹黑b嗜脂性染料特异性的对脂蛋白进行染色，采用线性梯度或非线性丙烯酰胺凝胶进行分离，但是线性梯度或非线性梯度制胶过程麻烦，需要梯度泵等仪器设备，电泳时间长等缺点。近期发展的还有免疫学检测方法等[leary et,wang t,baker dj,cilla dd,zhong j,warnick gr,nakajima k,havel rj.evaluation of an immunoseparation method for quantitative measurement of remnant
‑
like particle
‑
cholesterol in serum and plasma.clin chem.1998dec；44(12):2490
‑
8.]，需要抗体等试剂，不利于临床快速检测。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的是解决上述的不足，提供改良凝胶电泳检测血清中低密度脂蛋白的方法。
[0006]
为实现上述目的，本发明的技术解决方案是：改良凝胶电泳检测血清中低密度脂蛋白的方法，包括如下步骤：
[0007]
步骤1，样品采集：采集空腹12h以上的静脉血样品，在3h内对血清进行分离，若不能及时测定，将血清样本放置在
‑
80℃保存；
[0008]
步骤2，染色：取步骤1得到的血清70
‑
90ul，加入15
‑
25ul染液，混合均匀，在37℃水浴条件下孵育20min，之后进行离心，离心时间为8
‑
12min，离心转速为4000rpm，离心后取上清，得到染色后的血清；
[0009]
步骤3，凝胶管制备：取玻璃管固定在支架上，在玻璃管内加入分离胶，分离胶的胶层高度为71
‑
79mm，待凝胶表面聚合平整后，在玻璃管内加入浓缩胶，浓缩胶的胶层高度为6
‑
14mm，待凝胶表面聚合平整后，使用白炽灯光照30mim进行光聚合，得到凝胶管；
[0010]
步骤4，电泳：将步骤3制备得到的凝胶管垂直放入圆盘电泳槽，分别在正负极电泳槽内注入电泳缓冲液，将步骤2制备的染色后的血清缓慢加入凝胶管内，覆盖在分离胶的表
面，接通稳压电源，电流为2
‑
10ma/管，时间为1.5
‑
2h；
[0011]
进一步的，所述步骤2中使用的染液为苏丹黑b染液。
[0012]
进一步的，所述苏丹黑b染液的制备方法包括取0.25g苏丹黑b和25ml乙二醇混合，在50
‑
60℃加热5min，加热时不断搅拌，之后升温至100
‑
110℃，加热5min，趁热使用0.22um膜过滤，待冷却后，再用0.22um膜过滤一次，之后加入15ml蔗糖，混匀后避光保存。
[0013]
进一步的，所述步骤3中在加入分离胶之后缓慢注入100ul蒸馏水覆盖分离胶的表面，静置30min以上，待凝胶聚合平整后去掉水层。
[0014]
进一步的，所述步骤3中在加入浓缩胶之后缓慢注入100ul蒸馏水覆盖分离胶的表面，静置30min以上，待凝胶聚合平整后去掉水层。
[0015]
进一步的，所述步骤3中使用的分离胶的制备方法包括取0.857ml的35％的n,n
′‑
亚甲基双丙烯酰胺、2.5ml的1.5m ph8.8 tris
‑
hcl、0.1ml的10％aps、0.01ml的temed以及6.533ml的h2o。
[0016]
进一步的，所述步骤3中使用的浓缩胶的制备方法包括体积比为1:2:1:4的溶液a、溶液b、溶液c和溶液d；
[0017]
其中溶液a的制备方法包括取浓度为1mol/l的hcl 48ml、tris 5.98g、temed 0.46ml,加水至100ml,调节ph至6.7；
[0018]
溶液b的制备方法包括取丙烯酰胺10.0g，n,n
′‑
亚甲基双丙烯酰胺2.5g，加水至100ml；
[0019]
溶液c的制备方法包括取核黄素4mg，加水至100ml；
[0020]
溶液d的制备方法包括取蔗糖40g，加水至100ml。
[0021]
进一步的，所述步骤4中在正极槽内注入550
‑
600ml的电泳缓冲液，在负极槽内注入400
‑
500ml的电泳缓冲液。
[0022]
进一步的，所述步骤4中使用的电泳缓冲液的制备方法包括取80
‑
100mm的tris，70
‑
90mm的硼酸和2
‑
4mm的edta混合均匀，调节ph至8.3。
[0023]
苏丹黑b染液与每个脂蛋白中胆固醇的相对含量成比例地结合，预染色的脂蛋白随后进行电泳，在电泳的第一阶段，脂蛋白颗粒通过浓缩胶堆积成一个尖锐的窄带集中，当脂蛋白颗粒通过分离凝胶基质迁移时，由于凝胶的过筛作用，根据颗粒大小从大到小分解成脂蛋白带:hdl迁移最远，其次是小密度ldl，idl以及vldl等。
[0024]
对比现有技术，本发明具有如下的有益效果：
[0025]
1、本发明优化电泳条件使得极低密度脂蛋白(vldl)、中密度脂蛋白(idl)、低密度脂蛋白(ldl)和高密度脂蛋白(hdl)能够精确分离，优化了丙烯酰胺凝胶浓度和苏丹黑b染色液配置方法，实现精准分离和定量分析血清ldl；
[0026]
2、本发明的检测过程简单易行，不需要特殊的混合装置，并且电泳时间端，定量方法不需要放射性的物质，在性能上具有明显的优越性，使用快捷方便。
附图说明
[0027]
图1为本发明取临床已确诊心血管病人血清的凝胶电泳图谱。
[0028]
图2为本发明取健康人血清的凝胶电泳图谱。
具体实施方式
[0029]
下面结合实施例对本发明作进一步描述，以下实施例的实施方法，如未作特别说明，均为本领域公知的常规试剂及常规方法。
[0030]
其中乙二醇(ethyleneglycol,cas:107
‑
21
‑
1)，bcgrade(biochemicalreagent,生化试剂)。
[0031]
苏丹黑b(sudanblackb,cas:4197
‑
25
‑
5)，brgrade(biologicalreagent,生物染色试剂)。
[0032]
磷钨酸(phosphotungsticacid44
‑
hydrate，cas:12067
‑
99
‑
1)，bcgrade(biochemicalreagent,生化试剂)。
[0033]
tris(cas：77
‑
86
‑
1)，molecularbiologygrade(生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：a600194)。
[0034]
硼酸(cas:10043
‑
35
‑
3)，molecularbiologygrade(生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：a610044)。
[0035]
乙二胺四乙酸二钠(edta，cas:6381
‑
92
‑
6)，argrade(国药集团化学试剂有限公司，货号：10009717)。
[0036]
hcl(cas：7647
‑
01
‑
0)，argrade(国药集团化学试剂有限公司，货号：10009717)。
[0037]
过硫酸铵(aps,cas:7727
‑
54
‑
0)，acsgrade(生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：a100486)。
[0038]
丙烯酰胺(acrylamide，cas：79
‑
06
‑
1)，molecularbiologygrade(生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：a100341)。
[0039]
n,n
′‑
亚甲基双丙烯酰胺(n,n
’‑
methylenebisacrylamide，cas号110
‑
26
‑
9)(sigma
‑
aldrich，货号：m7256)。
[0040]
n,n,n',n'
‑
四甲基乙二胺(temed,cas:110
‑
18
‑
9)brgrade(生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：a100761)。
[0041]
核黄素(cas：83
‑
88
‑
5)，upsgrade(生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：a600470)。
[0042]
蔗糖(cas:57
‑
50
‑
1),argrade(国药集团化学试剂有限公司，货号：10021418)。
[0043]
所用试剂的公司为推荐公司，也可以使用其他公司的产品，但试剂的级别不得低于以上标识的级别。
[0044]
实施例1：
[0045]
改良凝胶电泳检测血清中低密度脂蛋白的方法，包括如下步骤：
[0046]
步骤1，样品采集：采集空腹12h的静脉血样品，在3h内对血清进行分离；
[0047]
步骤2，染色：取步骤1得到的血清70ul，加入15ul苏丹黑b染液，混合均匀，在37℃水浴条件下孵育20min，之后进行离心，离心时间为8min，离心转速为4000rpm，离心后取上清，得到染色后的血清；
[0048]
步骤3，凝胶管制备：取玻璃管固定在支架上，在玻璃管内加入分离胶，分离胶的胶层高度为71mm，缓慢注入100ul蒸馏水覆盖分离胶的表面，静置30min，待凝胶聚合平整后去掉水层，在玻璃管内加入浓缩胶，浓缩胶的胶层高度为6mm，缓慢注入100ul蒸馏水覆盖分离胶的表面，静置30min，待凝胶聚合平整后去掉水层，使用白炽灯光照30mim进行光聚合，得
到凝胶管；
[0049]
步骤4，电泳：将步骤3制备得到的凝胶管垂直放入圆盘电泳槽，分别在正极槽内注入550ml的电泳缓冲液，在负极槽内注入400ml的电泳缓冲液，将步骤2制备的染色后的血清缓慢加入凝胶管内，覆盖在分离胶的表面，接通稳压电源，电流为2ma/管，时间为1.5h；
[0050]
所述苏丹黑b染液的制备方法包括取0.25g苏丹黑b和25ml乙二醇混合，在50℃加热5min，加热时不断搅拌，之后升温至100℃，加热5min，趁热使用0.22um膜过滤，待冷却后，再用0.22um膜过滤一次，之后加入15ml蔗糖，混匀后避光保存。
[0051]
所述步骤3中使用的分离胶的制备方法包括取0.857ml的35％的n,n
′‑
亚甲基双丙烯酰胺、2.5ml的1.5m ph8.8 tris
‑
hcl、0.1ml的10％aps、0.01ml的temed以及6.533ml的h2o。
[0052]
所述步骤3中使用的浓缩胶的制备方法包括体积比为1:2:1:4的溶液a、溶液b、溶液c和溶液d；
[0053]
其中溶液a的制备方法包括取浓度为1mol/l的hcl 48ml、tris 5.98g、temed 0.46ml,加水至100ml,调节ph至6.7；
[0054]
溶液b的制备方法包括取丙烯酰胺10.0g，n,n
′‑
亚甲基双丙烯酰胺2.5g，加水至100ml；
[0055]
溶液c的制备方法包括取核黄素4mg，加水至100ml；
[0056]
溶液d的制备方法包括取蔗糖40g，加水至100ml。
[0057]
所述步骤4中使用的电泳缓冲液的制备方法包括取80mm的tris，70mm的硼酸和2mm的edta混合均匀，调节ph至8.3。
[0058]
实施例2：
[0059]
改良凝胶电泳检测血清中低密度脂蛋白的方法，包括如下步骤：
[0060]
步骤1，样品采集：采集空腹13h的静脉血样品，在3h内对血清进行分离；
[0061]
步骤2，染色：取步骤1得到的血清80ul，加入20ul苏丹黑b染液，混合均匀，在37℃水浴条件下孵育20min，之后进行离心，离心时间为10min，离心转速为4000rpm，离心后取上清，得到染色后的血清；
[0062]
步骤3，凝胶管制备：取玻璃管固定在支架上，在玻璃管内加入分离胶，分离胶的胶层高度为75mm，缓慢注入100ul蒸馏水覆盖分离胶的表面，静置35min，待凝胶聚合平整后去掉水层，在玻璃管内加入浓缩胶，浓缩胶的胶层高度为10mm，缓慢注入100ul蒸馏水覆盖分离胶的表面，静置35min，待凝胶聚合平整后去掉水层，使用白炽灯光照30mim进行光聚合，得到凝胶管；
[0063]
步骤4，电泳：将步骤3制备得到的凝胶管垂直放入圆盘电泳槽，分别在正极槽内注入575ml的电泳缓冲液，在负极槽内注入450ml的电泳缓冲液，将步骤2制备的染色后的血清缓慢加入凝胶管内，覆盖在分离胶的表面，接通稳压电源，电流为8ma/管，时间为1.7h；
[0064]
所述苏丹黑b染液的制备方法包括取0.25g苏丹黑b和25ml乙二醇混合，在55℃加热5min，加热时不断搅拌，之后升温至105℃，加热5min，趁热使用0.22um膜过滤，待冷却后，再用0.22um膜过滤一次，之后加入15ml蔗糖，混匀后避光保存。
[0065]
所述步骤3中使用的分离胶的制备方法包括取0.857ml的35％的n,n
′‑
亚甲基双丙烯酰胺、2.5ml的1.5m ph8.8 tris
‑
hcl、0.1ml的10％aps、0.01ml的temed以及6.533ml的
h2o。
[0066]
所述步骤3中使用的浓缩胶的制备方法包括体积比为1:2:1:4的溶液a、溶液b、溶液c和溶液d；
[0067]
其中溶液a的制备方法包括取浓度为1mol/l的hcl 48ml、tris 5.98g、temed 0.46ml,加水至100ml,调节ph至6.7；
[0068]
溶液b的制备方法包括取丙烯酰胺10.0g，n,n
′‑
亚甲基双丙烯酰胺2.5g，加水至100ml；
[0069]
溶液c的制备方法包括取核黄素4mg，加水至100ml；
[0070]
溶液d的制备方法包括取蔗糖40g，加水至100ml。
[0071]
所述步骤4中使用的电泳缓冲液的制备方法包括取90mm的tris，80mm的硼酸和3mm的edta混合均匀，调节ph至8.3。
[0072]
实施例3：
[0073]
改良凝胶电泳检测血清中低密度脂蛋白的方法，包括如下步骤：
[0074]
步骤1，样品采集：采集空腹14h的静脉血样品，在3h内对血清进行分离；
[0075]
步骤2，染色：取步骤1得到的血清90ul，加入25ul苏丹黑b染液，混合均匀，在37℃水浴条件下孵育20min，之后进行离心，离心时间为12min，离心转速为4000rpm，离心后取上清，得到染色后的血清；
[0076]
步骤3，凝胶管制备：取玻璃管固定在支架上，在玻璃管内加入分离胶，分离胶的胶层高度为79mm，缓慢注入100ul蒸馏水覆盖分离胶的表面，静置40min，待凝胶聚合平整后去掉水层，在玻璃管内加入浓缩胶，浓缩胶的胶层高度为14mm，缓慢注入100ul蒸馏水覆盖分离胶的表面，静置40min，待凝胶聚合平整后去掉水层，使用白炽灯光照30mim进行光聚合，得到凝胶管；
[0077]
步骤4，电泳：将步骤3制备得到的凝胶管垂直放入圆盘电泳槽，分别在正极槽内注入600ml的电泳缓冲液，在负极槽内注入500ml的电泳缓冲液，将步骤2制备的染色后的血清缓慢加入凝胶管内，覆盖在分离胶的表面，接通稳压电源，电流为10ma/管，时间为2h；
[0078]
所述苏丹黑b染液的制备方法包括取0.25g苏丹黑b和25ml乙二醇混合，在60℃加热5min，加热时不断搅拌，之后升温至110℃，加热5min，趁热使用0.22um膜过滤，待冷却后，再用0.22um膜过滤一次，之后加入15ml蔗糖，混匀后避光保存。
[0079]
所述步骤3中使用的分离胶的制备方法包括取0.857ml的35％的n,n
′‑
亚甲基双丙烯酰胺、2.5ml的1.5m ph8.8 tris
‑
hcl、0.1ml的10％aps、0.01ml的temed以及6.533ml的h2o。
[0080]
所述步骤3中使用的浓缩胶的制备方法包括体积比为1:2:1:4的溶液a、溶液b、溶液c和溶液d；
[0081]
其中溶液a的制备方法包括取浓度为1mol/l的hcl 48ml、tris 5.98g、temed 0.46ml,加水至100ml,调节ph至6.7；
[0082]
溶液b的制备方法包括取丙烯酰胺10.0g，n,n
′‑
亚甲基双丙烯酰胺2.5g，加水至100ml；
[0083]
溶液c的制备方法包括取核黄素4mg，加水至100ml；
[0084]
溶液d的制备方法包括取蔗糖40g，加水至100ml。
[0085]
所述步骤4中使用的电泳缓冲液的制备方法包括取100mm的tris，90mm的硼酸和4mm的edta混合均匀，调节ph至8.3。
[0086]
电泳结束后，关闭电源，取下凝胶管，用光学扫描仪对凝胶管进行扫描和成像，扫描单色光波长为610nm，以空白凝胶为统一参比，以相邻电泳峰之间的拐点作为分段标志，计算出各电泳峰下面积占血清脂蛋白整体的百分含量。
[0087]
实施例4：
[0088]
取临床已确认心血管病人血清和健康人的血清，使用实施例2的配方制备凝胶管，分别进行电泳，得到的电泳图谱如图1
‑
2所示。
[0089]
其中图1为本发明取临床已确诊心血管病人血清的凝胶电泳图谱，图2为本发明取健康人血清的凝胶电泳图谱，对比图1与图2可以看出，采用本发明方法，可以将染色后的血清分离，从而能够将ldl各亚型清晰分离，准确性较高，并且操作简便，提高了检测的效率。
[0090]
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。