一种用于诊断类风湿关节炎合并肺间质纤维化的生物标志物及其用途

1.本发明属于生物检测领域，具体涉及一种用于诊断类风湿关节炎合并肺间质纤维化的生物标志物及其用途。


背景技术：

2.类风湿关节炎(ra)是以对称性多关节炎为主要临床表现的慢性、进行性、系统性的自身免疫性疾病，滑膜增殖形成血管翳，造成对骨关节的侵蚀破坏，最后导致关节强直、畸形、功能失、致残率高。ra基本病理改变是滑膜炎，是一种常见的主要累及关节组织的慢性自身免疫病，一般不直接引起死亡，但可累及关节以外的其他脏器。由于肺有丰富的结缔组织和血液供应，是经常受累的脏器之一，ra最常见的肺间质病变(ild)主要包括肺间质纤维化，胸膜炎，肺类风湿结节，间质性肺炎，肺动脉高压等。其中肺间质纤维化是ra肺部受累常见的表现形式。随着病程延长，一旦发展到肺间质纤维化病变就不可逆转，严重时可导致死亡。在ra诊断分类标准不断发展的过程中，ra患者血清标志物在ra诊断过程中的地位越来越重要，由此不断将ra的诊断提前到疾病的早期诊断。ra的血清标志物在ra的诊疗中具有无可替代的作用，但是目前使用的ra血清标志物仍不理想。
3.糖组学作为一门从遗传学、生理学和病理学等多学科多角度研究生物糖组的一门学科，近年来得到了越来越多的关注。越来越多的证据表明，不同的自身免疫性疾病拥有不同的特征性的聚糖谱的表达。作为血清主要蛋白质之一，免疫球蛋白g(igg)糖基化在自身免疫性疾病的发病机制中的作用及其临床应用得到了充分的研究。例如，igg半乳糖基化水平在ra、系统性红斑狼疮、原发性干燥综合征中的表达水平均显著降低，但这些疾病患者若是处于疾病活动期时，其igg
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g0糖型的表达显著增高，并且与疾病的活动呈正相关。
4.鉴于糖基化在疾病中的重要作用，我们拟通过高通量的糖基化分析技术——凝集素微阵列技术来筛查ra
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ild患者血清igg糖基化的表达，以期探讨糖基化在ra
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ild中的临床应用价值。


技术实现要素：

5.为了解决上述问题，本发明提供一种用于诊断类风湿关节炎合并肺间质纤维化的生物标志物及其用途。
6.首先，本发明提供一种用于诊断类风湿关节炎合并肺间质纤维化的生物标志物，其为sba凝集素与igg结合所形成的复合物。
7.其中，所述的igg含有n
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乙酰半乳糖胺。
8.其次，本发明还提供所述生物标志物在用于制备诊断类风湿关节炎的试剂中的用途。
9.具体地，所述诊断包括：测定获自呈现igg相关性疾病的患者的生物样品中sba凝集素与igg结合所形成的复合物的水平；任选地，
10.与对照数据比较所述生物样品中sba凝集素与igg结合所形成的复合物的水平，其中，相对于所述对照数据，所述样品中sba凝集素与igg结合所形成的复合物的水平可检测地降低表明患类风湿关节炎的可能性。
11.进一步地，相对于非合并肺间质纤维化的类风湿关节炎患者的数据，sba凝集素与igg结合所形成的复合物的水平可检测地降低表明患类风湿关节炎合并肺间质纤维化的可能性。
12.其中，所述生物样品为血清样品。
13.本发明还提供sba凝集素在制备用于诊断类风湿关节炎的试剂中的用途。
14.其中，所述诊断包括：将sba凝集素与获自呈现类风湿性关节炎的患者的生物样品进行接触，测定sba凝集素与igg结合所形成的复合物的水平；任选地，
15.与对照数据比较所述生物样品中sba凝集素与igg结合所形成的复合物的水平，其中，相对于所述对照数据，所述样品中sba凝集素与igg结合所形成的复合物的水平可检测地降低表明患类风湿关节炎的可能性。
16.进一步地，相对于非合并肺间质纤维化的类风湿关节炎患者的数据，sba凝集素与igg结合所形成的复合物的水平的水平可检测地降低表明患类风湿关节合并肺间质纤维化的可能性。
17.其中，所述生物样品为血清样品。
18.在本发明一个具体实施方案中，sba凝集素与igg结合所形成的复合物的水平通过以下步骤来测量，包括：
19.a.使来自患者的生物样品与sba凝集素接触；
20.b.在生物样品中存在的igg与sba凝集素之间形成凝集素
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聚糖复合物；
21.c.洗涤来除去任何未结合的igg；
22.d.添加被标记的并且对来自生物样品的抗体为反应性的检测抗体；
23.e.洗涤来除去任何未结合的被标记的所述检测抗体；和
24.f.将所述检测抗体的标记物转化为可检测信号。
25.其中，所述的sba凝集素沉积或固定在固相表面载体上。
26.其中，所述的固相表面载体优选为乳胶珠子、多孔平板或膜条、纳米管道、带二维码的薄片等的形式。
27.其中，所述检测抗体通过共价连接到酶、具有荧光化合物或金属的标记物、或具有化学发光化合物的标记物来标记。
28.本发明通过采用凝集素微阵列检测类风湿关节炎(ra)患者血清igg分子与凝集素特异性结合的聚糖谱，结果显示，sba凝集素结合聚糖的含量在ra患者中是降低的。由于sba凝集素是特异性结合n
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乙酰半乳糖胺，这表明n
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乙酰半乳糖胺水平在ra患者中的表达是减少的。进一步研究发现，sba凝集素结合聚糖水平在ra相关肺间质病变(ra
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ild)患者中的表达较非合并ild的ra患者更低，表明sba凝集素结合聚糖水平可作为ra
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ild的生物学标志物。
附图说明
29.图1所示为凝集素微整列56个凝集素(三复孔)在阵列载玻片的布局。
30.图2所示为ra
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ild组、ra
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non ild组、dc组和hc组sba凝集素信号值比较。
31.图3所示为凝集素微阵列同批次标本sba凝集素印记验证图。
32.图4所示为凝集素微阵列同批次标本sba凝集素印记结果灰度值比较。
33.图5所示为新批次标本sba凝集素印记验证图。
34.图6新批次标本sba凝集素印记结果灰度值比较。
具体实施方式
35.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
36.实施例1凝集素微阵列分析血清igg糖基化
37.实验标本：纳入本次研究的研究对象分成三组：ra组(35例，其中有15例ra
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ild)，疾病对照组(dc，包括40例自身免疫性疾病，其中系统性红斑狼疮20例，特发性炎症性肌病20例)，健康对照组(hc，包括43例健康体检者)。研究对象资料见表1。其中ra组和dc组的诊断均符合相应疾病的诊断标准。入组的人群均采集新鲜血液，并立即分离出血清，
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80℃冻存备用。
38.表1凝集素微阵列检测118例研究对象的基本资料
[0039][0040]
由56种凝集素微组成的凝集素微阵列。将56种凝集素一式三份固定到芯片中，将每个患者的血清进行1:200稀释，添加到微阵列中，4℃孵育过夜。然后，抗igg
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cy5共轭在避光环境中与微阵列芯片杂交1小时。对所有蛋白的荧光强度进行了独立分析。并将芯片图像转换为数字格式进行分析。
[0041]
利用各凝集素点的信噪比(点的前景值与背景值的差值)计算了各凝集素点的信噪比(s/n)。为了防止凝集素微阵列在阵列间的偏置,我们使用阵列之间的归一化来归一化s/n数据。根据以下规则,通过组间的数据分布来确定凝集素结合力的显著性差异:(1)组间比较>1.7或<0.588；(2)组间比较检验类型，若符合正态性，选择t检验，否则选择非参数检验，若p值<0.05或者fisher检验p值<0.05或者[roc_auc>＝0.6并且roc_p值<0.05)]。
[0042]
采用含有56个凝集素的凝集素微阵列来检测实验标本中的糖基化状态(图1)。凝集素可特异性的结合糖蛋白末端的聚糖分子，形成复合物，通过不同的凝集素与聚糖的特异性结合来研究目的蛋白表面聚糖的种类与含量。凝集素微阵列因其高效的特点，现今已
越来越广泛的应用到糖基化的研究。冻存的标本室温平衡后，加入到凝集素微阵列，与之反应，再经过洗涤、封闭、荧光二抗反应和荧光检测等步骤，可获得每个凝集素与之特异结合聚糖的信号值，信号值与结合亲和力以及结合强度相关。
[0043]
为了确保收集到的荧光信号来源于igg的特定结合,我们使用cy5标记igg抗体。同时满足前述两种的凝集素s/n数据被认定为具有显著性差异，共筛选出6种凝集素(表2)。
[0044]
表2凝集素微阵列中具有显著性差异的凝集素
[0045][0046]
man：甘露糖；glcnac：n
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乙酰葡糖胺；glc：葡萄糖；galnac：n
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乙酰半乳糖胺；gal：半乳糖；dc：疾病对照组；hc：健康对照组。*：p<0.05；**：p<0.01。
[0047]
6种凝集素的亲和力信号值显示出四组样本之间有显著性差异。s/n数据显示ra
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ild患者组相对于ra
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non ild组、dc组和hc组的igg糖基化变化：(1)通过检测与刀豆凝集素a(cona)的结合增加，表明ra
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ild患者甘露糖糖链的增加(p均<0.05)；(2)通过检测与曼陀罗凝集素(dsl)结合的升高，表明ra
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ild患者n
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乙酰葡萄糖胺(glcnac)的升高(p均<0.05)；(3)通过检测与扁豆凝集素(lca)和豌豆凝集素(psa)的结合升高，表明ra
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ild患者葡萄糖(glc)的升高(p均<0.05)；(4)通过检测与辣木凝集素(黑接骨木)(mna
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m)结合的升高，表明ra
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ild患者半乳糖(gal)的升高(p均<0.05)；(5)通过检测与大豆凝集素(sba)的结合降低，表明ra
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ild患者n
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乙酰半乳糖胺(galnac)的降低(p均<0.05)。图2显示了ra
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ild组、ra
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non ild组、dc组和hc组lca凝集素信号值比较。
[0048]
实施例2血清凝集素印记验证实验
[0049]
为了进一步明确凝集素微阵列检测出来的差异表达糖基化，分别采用凝集素微阵列同批次的12例标本(6例ra
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ild，6例ra
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non ild)和新批次24例标本(9例ra
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ild，15例ra
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non ild，基本资料见表3)进行了凝集素印记进行验证。血清标本1：100稀释后，与上样缓冲液混合，100℃煮沸5分钟后，在10％的预制胶中进行sds
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page电泳，再将预制胶中蛋白电转移到pvdf膜中。将转印成功的pvdf膜进行封闭后，与cy3标记的凝集素进行杂交，最后通过荧光呈像仪检测荧光信号。荧光信号的强度与凝集素结合的糖蛋白糖基的结合力呈正比。
[0050]
通过对12例凝集素微整列同批次患者标本进行凝集素印记的结果比较(图3)，与
ra
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non ild患者相比，血清igg与sba凝集素的结合强度在ra
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ild患者中是降低的(图4)。此外，对24例新批次患者标本进行凝集素印记的结果比较(图5)，与ra
‑
non ild患者相比，血清igg与sba凝集素的结合强度在ra
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ild患者中同样是显著降低的(p均<0.05)(图6)。
[0051]
表3凝集素印记验证新批次ra患者的疾病资料
[0052][0053][0054]
结果表明，ra
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ild患者血清中sba凝集素结合的聚糖——n
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乙酰半乳糖胺水平是异常的，并且ra
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ild患者比ra
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non ild患者具有更低的sba凝集素结合聚糖水平，表明sba凝集素结合聚糖水平可作为ra
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ild的生物学标志物。