一种基于吖啶橙和碳点的比率荧光用于miRNA体外检测的方法

一种基于吖啶橙和碳点的比率荧光用于mirna体外检测的方法
技术领域
1.本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种基于吖啶橙和碳点的比率荧光用于mirna体外检测的方法。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.癌症对于人类健康构成严重威胁。统计数据显示，结直肠癌在全球的发病率以及死亡率均位列各种癌症的第三位，并呈逐年上升趋势。研究表明，通过早期筛查、诊断和治疗可以降低癌症的死亡率。早期结直肠癌患者治愈率高，5年生存率可达90％，但由于结直肠癌起病隐匿，早期不易发现，超过一半的患者在确诊时即已发生转移。转移性结直肠癌患者的5年生存率仅为10％，因此，结直肠癌患者的及早诊断为后续治疗争取宝贵时间、降低死亡率至关重要。
4.当前广泛使用的结直肠癌诊断方法有结肠气钡双重造影或钡灌肠、ct检查、b超和结直肠镜等。尽管这些传统的结直肠癌诊断方法已经获得临床应用，但是它们存在诊断灵敏度低、对人体损伤大、成本高等缺陷。因此，需要研发更先进的结直肠癌检测方法。当前，液体活检逐渐发展起来并引发了广泛关注。液体活检实质上是一种分子诊断技术，通常被看作是体外诊断的一种延伸，它将检测样本由相关组织延伸至血液、体液等液体，并且每次检测只需少量体液即可。因而，相对于传统的肿瘤检测技术，液体活检具有取样部位多样、病变发现及时、安全无并发症、能够预测病情发展、指导精准治疗以及预后等优势。
5.mirna具有组织特异性，能够在体液中稳定存在，是癌症早期诊断的可靠分子标志物，因而在肿瘤液体活检领域展现出广阔的发展前景。mirna检测能够进行癌症的早期筛查、临床诊断、个性化用药指导、肿瘤耐药性检测和预后检测。将mirna检测应用于结直肠癌的早期筛查具有重要的意义。随着新材料尤其是纳米材料的蓬勃发展，mirna的材料学检测成为了一个研究热点。在各种材料学检测方法中，荧光法因为具有灵敏度高、分析便捷、快速等特点而引起了科研工作者的广泛关注。但是，传统的荧光检测法存在易受背景荧光干扰以及系统复杂成分淬灭作用的不足。比率型荧光探针通过不同荧光波长处信号强度变化的比值表达检测信息，可以避免由背景荧光干扰、探针浓度波动等外部因素带来的对定量检测结果的干扰。因此，有必要构建比率型荧光探针以实现对包括结直肠癌特异性mirna在内的各种疾病特异性mirna的灵敏、特异性检测。


技术实现要素：

6.本发明的目的是针对当前mirna检测方法存在的不足，提出一种基于吖啶橙和碳点的比率荧光用于mirna体外检测的方法。该方法以柠檬酸和甲酰胺为反应物制备碳点，碳
点与吖啶橙组成荧光共振能量转移体系实现对mirna的比率荧光检测，其中吖啶橙为供体而碳点为受体。
7.本发明首先将待测mirna溶液加入dna探针溶液中，通过孵育使两者发生碱基互补配对，继而加入能够吸附于单链核酸的磷酸根和嵌入双链核酸的碱基对中的吖啶橙，最后加入表面带负电的碳点。吸附于单链核酸的吖啶橙能够随未发生碱基互补配对的dna探针吸附于碳点的表面发生荧光共振能量转移，使得吖啶橙的荧光强度减弱而碳点的荧光强度增强；反之，嵌入双链核酸的碱基对中的吖啶橙能够随发生碱基互补配对的dna探针/mirna双链不吸附于碳点的表面而不发生荧光共振能量转移，不会导致吖啶橙荧光强度的减弱和碳点荧光强度的增强。测试溶液的吖啶橙/碳点荧光强度比值，依据mirna浓度与吖啶橙/碳点荧光强度比值之间的标准曲线计算出待测mirna溶液的浓度。
8.本发明操作简便、灵敏度高、重复性和特异性好，是一种用于mirna体外检测的可靠方法。
9.本发明的技术解决方案是：
10.一种基于吖啶橙和碳点的比率荧光用于mirna体外检测的方法，该方法包括以下步骤：
11.(1)将1.8g柠檬酸溶解于30ml甲酰胺中并转移至聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中，于180℃反应6小时，待反应釜自然冷却至室温后向反应溶液中加入120ml丙酮并放至冰箱中，于
‑
20℃放置24小时产生碳点沉淀，以10000转/分钟离心20分钟分离碳点沉淀，将碳点沉淀加至30ml甲醇体积占10％的甲醇/丙酮混合液中，以10000转/分钟离心洗涤20分钟，重复离心洗涤3次后将碳点重新溶解于10ml甲醇中，用孔径为0.22μm的滤膜过滤除去大颗粒，向碳点的甲醇溶液中加入30ml丙酮，以10000转/分钟离心洗涤20分钟，于50℃干燥12小时得到红棕色碳点；
12.(2)配制浓度为10nm的dna探针溶液，向292μl dna探针溶液中加入3μl待测mirna溶液，于37℃孵育90分钟；
13.(3)向(2)的溶液中加入3μl浓度为1.76μm的吖啶橙溶液，吸附10分钟；
14.(4)向(3)的溶液中加入2μl浓度为0.1mg/ml的(1)中制备的碳点溶液，静置10分钟；
15.(5)用荧光分光光度计测试(4)中溶液的荧光强度，计算mirna的浓度。
16.所述(2)～(4)中所有溶液的溶剂均为超纯水。
17.所述dna探针的序列为(5
’‑3’
)：acaggccgggacaagtgcaata。
18.所述待测mirna(hsa
‑
mir
‑
92a
‑
3p)的序列为(5
’‑3’
)：uauugcacuugucccggccugu。
19.所述荧光分光光度计的参数设定：激发波长为492nm，发射波长检测范围为512～675nm。
20.本发明的有益效果在于：
21.本发明通过构建以吖啶橙为供体和碳点为受体的荧光共振能量转移体系实现了对mirna简便、灵敏、重复性好的比率荧光检测。该方法能够检测0.5～10nm浓度范围的mirna。该方法不仅能够检测结直肠癌特异性mirna(hsa
‑
mir
‑
92a
‑
3p)，也可以检测其它疾病特异性的mirna，在肿瘤疾病检测领域具有广阔的应用前景。本发明可为mirna的灵敏、特异性检测提供新途径，推动生物检测技术领域的发展。
附图说明
22.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
23.图1为实施例1制备的碳点的透射电镜图；
24.图2为实施例1制备的碳点的zeta电位图；
25.图3为吖啶橙的荧光发射和实施例1制备的碳点的荧光激发光谱；
26.图4为实施例1中不同浓度的mirna溶液的荧光强度图；
27.图5为实施例1的标准曲线。
具体实施方式
28.应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
29.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
30.一种基于吖啶橙和碳点的比率荧光用于mirna体外检测的方法，该方法包括以下步骤：
31.(1)将1.8g柠檬酸溶解于30ml甲酰胺中并转移至聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中，于180℃反应6小时，待反应釜自然冷却至室温后向反应溶液中加入120ml丙酮并放至冰箱中，于
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20℃放置24小时产生碳点沉淀，以10000转/分钟离心20分钟分离碳点沉淀，将碳点沉淀加至30ml甲醇体积占10％的甲醇/丙酮混合液中，以10000转/分钟离心洗涤20分钟，重复离心洗涤3次后将碳点重新溶解于10ml甲醇中，用孔径为0.22μm的滤膜过滤除去大颗粒，向碳点的甲醇溶液中加入30ml丙酮，以10000转/分钟离心洗涤20分钟，于50℃干燥12小时得到红棕色碳点；
32.(2)配制浓度为10nm的dna探针溶液，向292μl dna探针溶液中加入3μl待测mirna溶液，于37℃孵育90分钟；
33.(3)向(2)的溶液中加入3μl浓度为1.76μm的吖啶橙溶液，吸附10分钟；
34.(4)向(3)的溶液中加入2μl浓度为0.1mg/ml的(1)中制备的碳点溶液，静置10分钟；
35.(5)用荧光分光光度计测试(4)中溶液的荧光强度，计算mirna的浓度。
36.所述(2)～(4)中所有溶液的溶剂均为超纯水。
37.所述dna探针的序列为(5
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)：acaggccgggacaagtgcaata。
38.所述待测mirna(hsa
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)：uauugcacuugucccggccugu。
39.所述荧光分光光度计的参数设定：激发波长为492nm，发射波长检测范围为512～675nm。
40.下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。
41.以下实施例中，dna探针溶液、mirna溶液、吖啶橙溶液、碳点溶液的溶剂皆为超纯水。
42.实施例1：
43.碳点制备方法：将1.8g柠檬酸溶解于30ml甲酰胺中并转移至聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中，于180℃反应6小时，待反应釜自然冷却至室温后向反应溶液中加入120ml丙酮并放至冰箱中，于
‑
20℃放置24小时产生碳点沉淀，以10000转/分钟离心20分钟分离碳点沉淀，将碳点沉淀加至30ml甲醇体积占10％的甲醇/丙酮混合液中，以10000转/分钟离心洗涤20分钟，重复离心洗涤3次后将碳点重新溶解于10ml甲醇中，用孔径为0.22μm的滤膜过滤除去大颗粒，向碳点的甲醇溶液中加入30ml丙酮，以10000转/分钟离心洗涤20分钟，于50℃干燥12小时得到红棕色碳点。
44.碳点表征：如图1所示，碳点的直径约5～6nm；如图2所示，碳点的zeta电位为
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28.3mv；如图3所示，吖啶橙的荧光峰和碳点的激发峰接近，满足荧光共振能量转移的光谱条件。
45.标准曲线绘制：配制浓度为10nm的dna探针溶液，向6份292μl dna探针溶液中分别加入3μl浓度为0.05、0.1、0.3、0.5、0.7和0.9μm的mirna溶液，于37℃孵育90分钟；向溶液中加入3μl浓度为1.76μm的吖啶橙溶液，吸附10分钟；向溶液中加入2μl浓度为0.1mg/ml的碳点溶液，静置10分钟；用荧光分光光度计测试溶液的荧光得到图4，以mirna浓度为横坐标，以吖啶橙/碳点荧光强度比值为纵坐标，线性拟合各点得到如图5所示的标准曲线。
46.mirna检测实验：向292μl浓度为10nm的dna探针溶液中加入3μl mirna溶液，使mirna的终浓度为1nm，于37℃孵育90分钟后向其中加入3μl浓度为1.76μm的吖啶橙溶液并吸附10分钟，然后加入2μl浓度为0.1mg/ml的碳点溶液并静置10分钟，用荧光分光光度计测试溶液的荧光，依据图5中的标准曲线方程计算mirna的浓度为1.03nm，接近mirna的实际浓度。检测结果表明该检测方法具有较高的准确性。
47.实施例2：
48.向292μl浓度为10nm的dna探针溶液中加入3μl mirna溶液，使mirna的终浓度为8.5nm，于37℃孵育90分钟后向其中加入3μl浓度为1.76μm的吖啶橙溶液并吸附10分钟，然后加入2μl浓度为0.1mg/ml的碳点溶液并静置10分钟，用荧光分光光度计测试溶液的荧光，依据图5中的标准曲线方程计算mirna的浓度为8.43nm，接近mirna的实际浓度。检测结果表明该检测方法具有较高的准确性。
49.实施例3：
50.向3份292μl浓度为10nm的dna探针溶液中分别加入3μl三种对照mirna(序列从5’至3’，no.1(hsa
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mir
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223
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3p)：ugucaguuugucaaauacccca，no.2(mir
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92a
‑
3p
‑
tmt)：uuuuccacuugucccggccugu，no.3(mir
‑
92a
‑
3p
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smt)：uauuccacuugucccggccugu)溶液使对照mirna的终浓度为7nm，于37℃孵育90分钟后向其中分别加入3μl浓度为1.76μm的吖啶橙溶液并吸附10分钟，然后分别加入2μl浓度为0.1mg/ml的碳点溶液并静置10分钟，用荧光分光光度计测试溶液的荧光，依据图5中的标准曲线方程计算三种对照mirna的浓度分别为
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0.12、
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0.19和0.01nm，接近于0。检测结果表明该检测方法具有良好的特异性。
51.最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然
可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。