一种低场核磁共振检测鲜肉水分质量和/或水分含量的方法及其标准样品制备方法和应用

本发明是关于一种用于低场核磁共振技术检测鲜肉中水分质量和/或水分含量的标准样品制备方法及应用，属于食品技术研究领域。

背景技术：

在肉类生产、加工过程中，鲜肉中水分含量监测是产品质量控制的重要手段，在市场监管中，肉的水分含量是重要的筛查检测指标之一。国标中肉及肉制品的水分含量测定方法为干燥法和蒸馏法，虽然所需仪器设备简单、经济成本低且操作简单，但是存在能耗大、耗时长等缺点，不适合于市场快速筛查。根据现有的研究报道，用于鲜肉中水分含量快速测定的方法有很多，如低场核磁共振法、近红外光谱法等。其中，低场核磁共振法具有检测迅速、操作简单、样品需要量少、对待测样无破坏性以及能够观察到水分空间分布信息和分子迁移状态等特点，在食品领域有着广泛的应用，常用于肉及肉制品加工过程的水分分布和迁移测定、注水肉、注胶肉和解冻肉的筛查等。中国专利文献cn109115823a公开了一种基于低场核磁共振技术快速检测猪肉水分含量的方法，该法以水分质量为自变量，峰面积或总峰面积为因变量，建立一元线性拟合方程来测定猪肉中的实际水分含量。

上述方法虽然简单有效，但也可能存在实验室之间、仪器之间的差异。为了规避这种误差，有必要建立一套标准样品，适用于不同的实验室和低场核磁共振仪。作为标准样品，应具备几个特征：(1)能够恢复到鲜肉相近的状态，尤其是肉的结构、水分含量等，这样才能真实的反应出方法的可靠性；(2)易保存，即可以在常温或低温下长期保存，不发生腐败变质、氧化等；(3)可重复，可以制备出不同水分梯度，分别进行低场核磁共振分析，进而获得水分含量与峰面积之间的线性关系，同时肉样大小应与实际测定的大小等比较接近。能够同时满足上述三个特征的标准肉样制备方法是真空冷冻干燥法。

真空冷冻干燥技术是先将物质中的水分在低温下冻结，然后在真空条件下使冻结的水分去除的干燥技术。在冷冻干燥前后，物质的物理和化学性质以及生物性状基本保持不变，食品在冷冻干燥过程中有效地避免了热敏反应和氧化作用，即在保持原有营养品质的前提下有效地去除水分，因而该技术在食品领域产品的研发中也得到了广泛的应用。在肉的冷冻干燥研究方面，黄少烈，罗勇，梅慈云(1991，制冷学报)研究表明冷冻干燥可以较好地保持新鲜蛇肉的色香味和营养成分；程江，王华祥，杨卓如，等(1997，全国第五届冷冻干燥学术交流会论文集)报道了火鸡肉和牛肉等物料冷冻干燥动力学；qixiling,jinzhijin,liweiyi,zhengzonghe(2000,transactionsoftianjinuniversity)报道了牛肉冷冻干燥过程中热质传递特性；另有几项研究报道了熟的即食鸡肉丁、牦牛肉冻干工艺和品质变化(张晋陆，1998，中国家禽；赵娟红，罗章，马美湖等，2018，肉类研究；吴满刚，王俊山，段立昆，等，2019，食品与发酵工业)，但这些研究的目的在于开发冻干的熟肉制品，满足市场消费需求，且由于冻干前肉样经过了热处理，肉的组分和结构已遭到严重破坏，失去了鲜肉原有的特性，因此无法满足鲜肉水分检测标准样品的需求。此外，不同ph的肉样水分含量不同，保持水分或冻干样品的复水能力也可能存在很大差异；宰前注水肉也会影响肉的水分保持能力，这些肉都不适合于制作标准样品。

综上，低场核磁共振技术在鲜肉水分含量快速测定中具有显著优势，但标准样品制备和标准曲线制作方法是实现广泛推广，保障测定结果准确性的基础。而此领域目前尚属于空白。

技术实现要素：

本发明的目的在于建立一种应用低场核磁共振技术快速检测鲜肉中水分质量的标准样品制备方法，提供一种标准曲线的制备方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明的第一个目的是提供一种低场核磁共振检测鲜肉水分质量和/或水分含量的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)标准肉样的选择：根据待测肉样的种类选取同类肉源的生鲜肉作为标准肉样，所述标准肉样ph值为5.5～5.8；肉的ph影响肉的保水性，在本发明检测方法中ph在5.5-5.8范围内，肉的保水性最好。原料选择时可采用常规ph测定方法，如用便携式ph计测定即可作出判断。ph值不符合5.5～5.8范围的肉样不能用来制备标准样品。

(2)肉柱的制备：切分步骤(1)中的标准肉样，切取大小、形状和质量均相近的鲜肉柱；

(3)肉柱的冻结：将步骤(2)中制备的肉柱置于-20℃下冻结10～12小时；

(4)冷冻干燥：将经步骤(3)冻结的肉柱放置于真空冷冻干燥机内进行冷冻干燥，所述冷冻干燥的真空度小于1pa，冷冻干燥时间为36～48小时；

(5)合格标准样品的判定：经步骤(4)冷冻干燥后的标准样品需同时满足以下三项标准：①冷冻干燥后肉柱质量不低于鲜肉柱质量的23％；②肉柱呈多孔状结构；③结构完整，无破损，获得用于低场核磁共振检测鲜肉水分的标准样品；因为冷冻干燥后的肉样非常松脆，很容易受损，受损的样品会出现质量的改变，复水能力的改变，达不到预期制备标准曲线的效果，因此必须要控制标准样品结构完整，无破损。肉柱呈多孔状结构有利于后续的复水效果。按照国家规定的畜禽肉水分限量标准猪肉、牛肉、鸡肉的含水量>77％，即可判为注水肉，或含水量超标，因此限定冷冻干燥后肉柱质量不低于鲜肉柱质量的23％，即原肉样中水分不得高于77％，如果高于77％，即为注水肉，不能使用。

(6)冻干标准样品的复水：取步骤(5)制备得到的标准样品，以不同比例添加水，梯度复水；优选的，所述梯度复水为分别以1％、5％、10％、30％、50％和70％的复水比例进行复水。

(7)低场核磁共振分析：同一冻干标准肉样，按照由少到多的顺序添加水分，每次添加水分后进行低场核磁共振分析，获得t2弛豫时间图谱不易流动水、结合水、自由水的峰面积，将不易流动水、结合水、自由水三者峰面积相加，获得t2弛豫时间图谱总峰面积；

优选的，所述复水的水分添加量计算公式如下：

在某个特定的实施例中，所述低场核磁共振分析条件为：采用micronmr型微型核磁共振成像仪，cpmg序列参数为：tw为4500ms，sw为250khz，ns为8，te为0.2ms，回波个数为2000，rg1为20db，sf为21mhz，rfd为0.08ms；反演参数为抽样范围：0.01-2000ms，抽样点数为2000，迭代次数为1000000；

(8)一元线性拟合模型的建立：以每一标准样品在不同复水比例时添加的水分质量为自变量，其基于步骤(7)低场核磁共振分析反演得到的数据结果，提取每一标准样品的t2弛豫时间图谱总峰面积作为一元线性拟合模型的因变量；建立冻干标准样品复水一元线性拟合方程；

优选的，本步骤还包括一元线性拟合模型的验证：取步骤(2)中鲜肉柱，按照步骤(7)所述的低场核磁共振分析条件，测定获取待测样品的t2弛豫时间图谱总峰面积，代入步骤(8)建立的一元线性拟合模型，推算出待测肉样中的预测水分质量，之后测定鲜肉柱的实际水分质量，对比预测水分质量和实际水分质量，检验步骤(8)建立的一元线性拟合模型的准确性；

(9)计算待测样品中的水分质量：取待测肉样，分切成与步骤(2)中鲜肉柱大小、形状和质量均相近的肉柱，按照步骤(7)所述的低场核磁共振分析条件，测定获取待测样品的t2弛豫时间图谱总峰面积，代入步骤(8)建立的一元线性拟合模型，计算出待测样品中的水分质量，进而根据水分质量计算待测样品中的水分含量，所述待测样品中的水分含量＝待测样品中的水分质量(g)÷待测样品质量(g)×100。

进一步的，步骤(1)所述生鲜肉为生鲜猪肉、生鲜牛肉或生鲜鸡肉；

优选的，所述生鲜猪肉为宰后24小时的猪腰大肌或背最长肌，所述生鲜牛肉为宰后24小时的牛腰大肌，所述生鲜鸡肉为宰后12小时的鸡胸肉。

进一步的，步骤(2)中，所述鲜肉柱的大小为根据低场核磁共振仪设置为1cm×1cm×2cm，鲜肉柱的质量为3.0克/个。

进一步的，步骤(8)所得一元线性拟合方程分别为：

猪肉冻干标准样品复水线性模型：s＝755.16m1+69.581(r²＝0.9865)；

牛肉冻干标准样品复水线性模型：s＝755.13m1+41.394(r²＝0.9943)；

鸡肉冻干标准样品复水线性模型：s＝798.2m1+37.045(r²＝0.9904)；

式中，s为t2弛豫时间图谱总峰面积，m1为添加水分的质量(g)。

进一步的，步骤(8)测定鲜肉柱的实际水分质量采用冷冻干燥法或烘干法。

本发明的第二个目的是提供一种用于低场核磁共振检测鲜肉水分质量和/或水分含量的标准样品制备方法，所述方法包括以下步骤：

(1)标准肉样的选择：根据待测肉样的种类选取同类肉源的生鲜肉作为标准肉样，所述标准肉样ph值为5.5～5.8；

(2)肉柱的制备：切分步骤(1)中的标准肉样，切取大小、形状和质量均相近的鲜肉柱；

(3)肉柱的冻结：将步骤(2)中制备的肉柱置于-20℃下冻结10～12小时；

(4)冷冻干燥：将经步骤(3)冻结的肉柱放置于真空冷冻干燥机内进行冷冻干燥，所述冷冻干燥的真空度小于1pa，冷冻干燥时间为36～48小时；

(5)合格标准样品的判定：经步骤(4)冷冻干燥后的标准样品需同时满足以下三项标准：①冷冻干燥后肉柱质量不低于鲜肉柱质量的23％；②肉柱呈多孔状结构；③结构完整，无破损，获得所述用于低场核磁共振检测鲜肉水分的标准样品。

进一步的，步骤(1)所述生鲜肉为生鲜猪肉、生鲜牛肉或生鲜鸡肉；

优选的，所述生鲜猪肉为宰后24小时的猪腰大肌或背最长肌，所述生鲜牛肉为宰后24小时的牛腰大肌，所述生鲜鸡肉为宰后12小时的鸡胸肉。

进一步的，步骤(2)中，所述鲜肉柱的大小为1cm×1cm×2cm，鲜肉柱的质量为3.0克/个。

本发明的第三个目的是提供一种用于低场核磁共振检测鲜肉水分质量和/或水分含量的标准样品，所述标准样品采用前述的用于低场核磁共振检测鲜肉水分质量和/或水分含量的标准样品制备方法制备得到。

本发明的第四个目的是提供前述的用于低场核磁共振检测鲜肉水分检测的标准样品在低场核磁共振检测鲜肉水分质量和/或水分含量中的应用。

所述应用包括以下步骤：

(1)标准肉样的选择：根据待测肉样的种类选取同类肉源的生鲜肉作为标准肉样，所述标准肉样ph值为5.5～5.8；肉的ph影响肉的保水性，在本发明检测方法中ph在5.5-5.8范围内，肉的保水性最好。原料选择时可采用常规ph测定方法，如用便携式ph计测定即可作出判断。ph值不符合5.5～5.8范围的肉样不能用来制备标准样品。

(2)肉柱的制备：切分步骤(1)中的标准肉样，切取大小、形状和质量均相近的鲜肉柱；

(3)肉柱的冻结：将步骤(2)中制备的肉柱置于-20℃下冻结10～12小时；

(4)冷冻干燥：将经步骤(3)冻结的肉柱放置于真空冷冻干燥机内进行冷冻干燥，所述冷冻干燥的真空度小于1pa，冷冻干燥时间为36～48小时；

(5)合格标准样品的判定：经步骤(4)冷冻干燥后的标准样品需同时满足以下三项标准：①冷冻干燥后肉柱质量不低于鲜肉柱质量的23％；②肉柱呈多孔状结构；③结构完整，无破损，获得用于低场核磁共振检测鲜肉水分的标准样品；因为冷冻干燥后的肉样非常松脆，很容易受损，受损的样品会出现质量的改变，复水能力的改变，达不到预期制备标准曲线的效果，因此必须要控制标准样品结构完整，无破损。肉柱呈多孔状结构有利于后续的复水效果。按照国家规定的畜禽肉水分限量标准猪肉、牛肉、鸡肉的含水量>77％，既可判为注水肉，或含水量超标，因此限定冷冻干燥后肉柱质量不低于鲜肉柱质量的23％，即原肉样中水分不得高于77％，如果高于77％，即为注水肉，不能使用。

(6)冻干标准样品的复水：取步骤(5)制备得到的标准样品，以不同比例添加水，梯度复水；优选的，所述梯度复水为分别以1％、5％、10％、30％、50％和70％的复水比例进行复水。

(7)低场核磁共振分析：同一冻干标准肉样，按照由少到多的顺序添加水分，每次添加水分后进行低场核磁共振分析，获得t2弛豫时间图谱不易流动水、结合水、自由水的峰面积，将不易流动水、结合水、自由水三者峰面积相加，获得t2弛豫时间图谱总峰面积；

优选的，所述复水的水分添加量计算公式如下：

在某个特定的实施例中，所述低场核磁共振分析条件为：采用micronmr型微型核磁共振成像仪，cpmg序列参数为：tw为4500ms，sw为250khz，ns为8，te为0.2ms，回波个数为2000，rg1为20db，sf为21mhz，rfd为0.08ms；反演参数为抽样范围：0.01-2000ms，抽样点数为2000，迭代次数为1000000；

(8)一元线性拟合模型的建立：以每一标准样品在不同复水比例时添加的水分质量为自变量，其基于步骤(7)低场核磁共振分析反演得到的数据结果，提取每一标准样品的t2弛豫时间图谱总峰面积作为一元线性拟合模型的因变量；建立冻干标准样品复水一元线性拟合方程；

优选的，本步骤还包括一元线性拟合模型的验证：取步骤(2)中鲜肉柱，按照步骤(7)所述的低场核磁共振分析条件，测定获取待测样品的t2弛豫时间图谱总峰面积，代入步骤(8)建立的一元线性拟合模型，推算出待测肉样中的预测水分质量，之后测定鲜肉柱的实际水分质量，对比预测水分质量和实际水分质量，检验步骤(8)建立的一元线性拟合模型的准确性；

(9)计算待测样品中的水分质量：取待测肉样，分切成与步骤(2)中鲜肉柱大小、形状和质量均相近的肉柱，按照步骤(7)所述的低场核磁共振分析条件，测定获取待测样品的t2弛豫时间图谱总峰面积，代入步骤(8)建立的一元线性拟合模型，计算出待测样品中的水分质量，进而根据水分质量计算待测样品中的水分含量，所述待测样品中的水分含量＝待测样品中的水分质量(g)÷待测样品质量(g)×100。

进一步的，步骤(1)所述生鲜肉为生鲜猪肉、生鲜牛肉或生鲜鸡肉；

优选的，所述生鲜猪肉为宰后24小时的猪腰大肌或背最长肌，所述生鲜牛肉为宰后24小时的牛腰大肌，所述生鲜鸡肉为宰后12小时的鸡胸肉。

进一步的，步骤(2)中，所述鲜肉柱的大小为根据低场核磁共振仪设置为1cm×1cm×2cm，鲜肉柱的质量为3.0克/个。

进一步的，步骤(8)所得一元线性拟合方程分别为：

猪肉冻干标准样品复水线性模型：s＝755.16m1+69.581(r²＝0.9865)；

牛肉冻干标准样品复水线性模型：s＝755.13m1+41.394(r²＝0.9943)；

鸡肉冻干标准样品复水线性模型：s＝798.2m1+37.045(r²＝0.9904)；

式中，s为t2弛豫时间图谱总峰面积，m1为添加水分的质量(g)。

进一步的，步骤(8)测定鲜肉柱的实际水分质量采用冷冻干燥法或烘干法。

本发明技术方案的有益效果在于：

(1)本发明突破性的首次采用鲜肉而不是熟肉作为冻干的原材料，保证肉块其他物理、化学及生物组织不变，在保持肉块的原有生物结构的基础上以冻干的方式去除水分，同时未对其它营养成分造成影响，严格控制单一变量，使其更加准确，而且由于标准肉样呈多孔状结构，具有良好的复水效果。

(2)本发明中鲜肉块的大小可以控制，容易实现标准化。

(3)本发明中对冻干肉样通过外加水的形式呈现水分含量梯度，比对不同水分含量下用低场核磁共振测定t2弛豫时间，并根据测定所得的t2弛豫时间图谱总峰面积与不同复水比例下肉块中添加的水分质量之间建立一元线性拟合方程，为基于低场核磁共振技术快速检测肉品中水分含量提供了标准样品。

(4)采用本发明的方法，对于待测肉样，只需采用低场核磁共振获得t2弛豫时间图谱总峰面积，应用一元线性方程，即可计算出待测样品中的水分质量。

附图说明

图1为不同复水比例下冻干猪外脊肉块的形态；

图2为不同复水比例下冻干牛里脊肉块的形态；

图3为不同复水比例下冻干鸡胸肉块的形态；

图4冻干猪外脊肉块复水过程中含水量与t2弛豫时间图谱总峰面积一元线性拟合图；

图5冻干牛里脊肉块复水过程中含水量与t2弛豫时间图谱总峰面积一元线性拟合图；

图6冻干鸡胸肉块复水过程中含水量与t2弛豫时间图谱总峰面积一元线性拟合图。

具体实施方式

以下结合具体实施方式对本方法进行详细说明，但本发明的保护范围不限于此。

实施例1

(1)标准样品准备：取猪外脊肉、牛里脊肉、鸡胸肉，测定肉样ph值分别为5.6，5..7和5.7。

(2)肉柱的制备：将步骤(1)中的标准肉样分别切成30个剔除含较多脂肪和结缔组织的1cm×1cm×2cm的肉柱，质量为3.0g/个。

(3)肉柱的冻结：将步骤(2)中制备的肉柱置于-20℃下冻结10小时。

(4)冷冻干燥：将经步骤(3)冻结的肉柱放置于真空冷冻干燥机内进行冷冻干燥，所述冷冻干燥的真空度小于1pa，冷冻干燥时间为36小时。

(5)合格标准样品的判定：经步骤(4)冷冻干燥后的标准样品需同时满足以下三项标准：①冷冻干燥后肉柱质量不低于鲜肉柱质量的23％；②肉柱呈多孔状结构；③结构完整，无破损，获得用于低场核磁共振检测鲜肉水分的标准样品。

(6)冻干标准样品的复水：将步骤(5)制备好的合格猪肉标准样品(29个)、合格牛肉标准样品(27个)、合格鸡肉标准样品(30个)，按照1％、5％、10％、30％、50％和70％比例进行逐次复水，复水后的猪肉、牛肉和鸡肉实物图分别见附图1、2和3。所述复水的水分添加量计算公式如下：

(7)低场核磁共振分析：同一冻干标准肉样，按照由少到多的顺序添加水分，每次添加水分后进行低场核磁共振分析，(即，按照1％比例复水后进行低场核磁共振分析，分析结束后，将该样品再按照5％比例复水后进行低场核磁共振分析，分析结束后，将该样品再按照10％比例复水后进行低场核磁共振分析……以此类推)获得t2弛豫时间图谱不易流动水、结合水、自由水的峰面积和总峰面积；

所述低场核磁共振分析条件为：采用micronmr型微型核磁共振成像仪，cpmg序列参数为：tw为4500ms，sw为250khz，ns为8，te为0.2ms，回波个数为2000，rg1为20db，sf为21mhz，rfd为0.08ms。反演参数为抽样范围：0.01-2000ms,抽样点数为2000，迭代次数为1000000。以得到猪肉、牛肉和鸡肉的峰总面积分别见表1、2和3。对于猪肉和鸡肉，复水比达到70％时，添加水分不能完全被吸收，因此结果数据没有列出，也没有纳入线性模型拟合。

(8)一元线性拟合模型的建立：以每一标准样品添加水分质量为自变量，其基于步骤(7)低场核磁共振分析反演得到的数据结果，提取每一标准样品的所测得的t2弛豫时间图谱总峰面积为因变量，建立一元线性拟合方程，所得方程分别为：

猪肉冻干标准样品复水线性模型：s＝755.16m1+69.581(r²＝0.9865)

牛肉冻干标准样品复水线性模型：s＝755.13m1+41.394(r²＝0.9943)

鸡肉冻干标准样品复水线性模型：s＝798.2m1+37.045(r²＝0.9904)

式中，s为t2弛豫时间图谱总峰面积，m1为添加水分的质量(g)。

表1.冻干猪肉块复水后的低场核磁共振检测结果

表2.冻干牛肉复水后的低场核磁共振检测结果

表3.冻干鸡肉复水后的低场核磁共振检测结果

(9)计算待测样品中的水分质量并验证步骤(8)获得的一元线性拟合模型：取新鲜的猪外脊肉、猪后腿肉、猪里脊肉、牛里脊肉、鸡胸肉各10份，作为待测样品，用上述步骤(2)的样品处理方法分切成与步骤(2)中鲜肉柱大小、形状和质量均相近的肉柱，采用步骤(7)中所述的低场核磁共振方法测得各待测样品t2弛豫时间图谱峰总面积，根据待测肉样的种类，分别代入步骤(8)中建立的同类肉源的线性拟合模型，反馈计算出肉中水分质量，同时用冷冻干燥法测定肉中的实际水分质量，所述冷冻干燥法主要操作步骤为将肉样切成1cm×1cm×2cm的肉柱，质量为3.0g/个，将肉柱置于-20℃下冻结10小时，将冻结的肉柱放置于真空冷冻干燥机内进行冷冻干燥，冷冻干燥时间为36小时，冷冻干燥前后分别称量肉柱质量，两次质量之差即为水分的实际质量。具体结果见表4、5。可以看出，采用本发明低场核磁共振检测鲜肉水分质量的方法得到的预测值和实际值非常接近，表明本发明建立的方法准确性较高，能够用于检测鲜肉水分质量和/或含量。

表4中，准确率(％)＝∣预测值-真实值∣÷真实值×100。

表4.验证集样品的水分质量预测值与实际值

基于表4中的水分质量，进而测算出待测样品中水分的百分比含量(表5)，待测肉样中的水分百分比含量预测值或真实值(％)＝水分质量预测值或真实值(g)÷样品质量(g)×100；准确率(％)＝∣预测值-真实值∣÷真实值×100。

表5.验证集样品的水分含量预测值与实际值

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。