一种薄层色谱的构建方法和同时鉴定金银花和甘草成分的方法及其应用与流程

1.本发明属于中药检测技术领域，具体涉及一种薄层色谱的构建方法和同时鉴定金银花和甘草成分的方法及其应用。


背景技术：

2.随着人民群众健康保健意识的增强，对中成药产品的质量和安全性等有了更高的要求。四妙勇安汤由金银花、玄参、当归、甘草四味药物组成。用于脱疽(即血栓闭塞性脉管炎)，证见患处黯红，微热微肿，痛甚，烦热口渴，或则溃烂，脓水淋漓，舌红脉数等。功效清热解毒，活血止痛。
3.薄层色谱是将样品溶液用管口平整的毛细管滴加于离薄层板一端约1cm处的起点线上，晾干或吹干后置薄层板于盛有展开剂的展开槽内。待展开剂前沿离顶端约1cm附近时，将色谱板取出，干燥后喷以显色剂，或在紫外灯下显色，得到的色谱图。薄层色谱法(tlc)，系根据样品的比移值(rf)与适宜的对照物按同法所得的色谱图的比移值(rf)作对比，用以进行药品的鉴别、杂质检查或含量测定的方法，具有操作简单、快速、成本低廉的优点，在中药产品成分鉴定和质量检测中均有广泛使用。
4.目前四妙勇安汤中有效成分如何鉴别还未见标准颁布，现有的四妙勇安汤的鉴别方法一般采用绿原酸的含量为指标，然而采用单一成分不能全面反映中药制剂内在的化学成分和种类，进而反映中药质量。例如蒋建勤等公开了一种四妙勇安汤中绿原酸的含量测定，采用乙酸丁酯
‑
甲酸
‑
水(4:3:3)上层液为展开剂进行薄层色谱鉴别，仅能对金银花进行鉴别，无法同时鉴别甘草或者其他药材成分，方法也较繁琐。
5.因此，亟需建立一种能够快速、准确且同时鉴定四妙勇安汤复方制剂及物质基准实物中金银花和甘草成分的方法，以保证其质量的均一、稳定、可靠。


技术实现要素：

6.因此，本发明的目的在于解决现有技术中四妙勇安汤或者其复方制剂无法快速、准确且同时鉴定金银花和甘草成分的问题。
7.为此，本发明提供了一种薄层色谱的构建方法，包括如下步骤：
8.四妙勇安汤供试品溶液的制备：取四妙勇安汤供试品、水与正丁醇混合，固液分离，取液体，得到供试品溶液；
9.对供试品溶液进行薄层色谱检测，即得供试品的薄层色谱。
10.在某些优选的实施方式中，薄层色谱检测采用乙酸丁酯
‑
甲酸
‑
水的上层液为展开剂，尤其是采用体积比为5
‑
10：2.5：2.5
‑
7.5的乙酸丁酯
‑
甲酸
‑
水的上层液为展开剂。
11.上层液是指乙酸丁酯、甲酸和水混合，然后置于分液漏斗中混合，静置分层后得上清液即得。
12.进一步的，薄层色谱检测中，在薄层板上点样供试品溶液，采用的薄层板为硅胶g
薄层板；
13.优选的，薄层板的长度≥10cm，更优选为10
‑
20cm；
14.优选的，点样体积为3
‑
30μl；更优选为3
‑
10μl。
15.进一步的，薄层色谱检测中，采用香草醛硫酸溶液或者硫酸乙醇溶液为显色剂。
16.优选的，采用质量百分数为2％～5％的香草醛的硫酸溶液或体积百分数为10％硫酸的乙醇溶液。
17.在某些优选的实施方式中，供试品溶液的制备方法包括，取四妙勇安汤供试品、水与正丁醇混合，固液分离，取液体，得到供试品溶液。
18.进一步的，所述四妙勇安汤供试品的质量与水、正丁醇的体积之比为0.5
‑
1.5：5
‑
15：5。
19.进一步的，所述固液分离为离心和/或过滤。
20.优选的，离心的时间为5
‑
10min，转速为2000
‑
4000转/分钟。
21.优选的，过滤步骤之前还包括超声步骤。
22.更优选的，超声时间为5
‑
20分钟。
23.进一步的，所述四妙勇安汤供试品选自四妙勇安汤或者其复方制剂。
24.其中，四妙勇安汤的复方制剂是由四妙勇安汤按照药学上常规工艺，加入或者不加药学上常规辅料制成的复方制剂。
25.优选的，所述四妙勇安汤的复方制剂选自固体制剂、半固体制剂或者液体制剂。
26.其中，固体制剂可以但不局限于片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂等；
27.半固体制剂可以但不局限于软膏剂、糊剂、乳膏剂等；
28.液体制剂可以但不局限于合剂、口服液、注射剂、乳剂、混悬剂、纳米液体制剂等。
29.四妙勇安汤的复方制剂的粉剂可以选择四妙勇安汤物质基准实物。
30.本发明还提供了本发明中任一所述的构建方法得到的薄层色谱。
31.本发明还提供了一种同时鉴定金银花和甘草成分的方法，包括将待测四妙勇安汤供试品的薄层色谱与对照品的薄层色谱比较的步骤；以及，将待测四妙勇安汤供试品的薄层色谱与对照药材的薄层色谱比较的步骤；
32.其中，所述待测四妙勇安汤供试品的薄层色谱为使用待测四妙勇安汤供试品并且按照本发明任一所述的构建方法得到。
33.所述对照药材的薄层色谱为分别采用甘草药材和金银花药材代替四妙勇安汤供试品并且按照本发明任一所述的构建方法得到。也就是说，采用甘草药材和金银花药材分别按照本发明供试品溶液的制备方法同法制备甘草对照药材溶液和金银花对照药材溶液。然后分别取甘草对照药材溶液和金银花对照药材溶液按照本发明任一所述的构建方法进行薄层色谱检测，即得甘草对照药材的薄层色谱和金银花对照药材的薄层色谱。
34.所述对照品的薄层色谱为采用绿原酸、3,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸、4,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸中的至少一种和甘草苷分别制成对照品溶液并且按照本发明任一所述的构建方法得到。
35.对照品溶液的制备中，绿原酸、3,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸、4,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸中的至少一种和甘草苷分别与甲醇混合，即得各对照品溶液。每1ml各对照品溶液中含0.5
‑
2mg相应的对照品。
36.本发明中，可以将对照品溶液和/或对照药材溶液与供试品溶液点样于同一薄层板上，方便观察，节约成本。
37.而且研究发现，绿原酸、3,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸、4,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸对照品溶液容易分解，可以采用最后点样或者覆盖保护板的方式避免分解。
38.具体的，为了改善对照品分解，提高鉴定的准确度和效率，在某些优选的实施方式中，先点样其他溶液，再点样绿原酸、3,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸、4,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸对照品溶液中的至少一种。或者展开前采用保护装置覆盖绿原酸、3,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸、4,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸对照品溶液中的至少一种制作的样品点。
39.本发明的另一个目的在于解决现有技术中四妙勇安汤或者其复方制剂中的甘草成分无法快速、准确鉴别的缺陷。
40.为此，本发明还提供了一种鉴定甘草成分的方法，包括将待测四妙勇安汤供试品的薄层色谱与对照品的薄层色谱比较的步骤；和/或，将待测四妙勇安汤供试品的薄层色谱与对照药材的薄层色谱比较的步骤。
41.其中，所述待测四妙勇安汤供试品的薄层色谱为使用待测四妙勇安汤供试品并且按照本发明任一所述的构建方法得到。
42.所述对照药材的薄层色谱为采用甘草药材代替四妙勇安汤供试品并且按照本发明任一所述的构建方法得到。也就是说，采用甘草药材按照本发明供试品溶液的制备方法同法制备甘草对照药材溶液，然后取甘草对照药材溶液按照本发明任一所述的构建方法进行薄层色谱检测，即得甘草对照药材的薄层色谱。
43.所述对照品的薄层色谱为采用甘草苷制对照品成对照品溶液并且按照本发明任一所述的构建方法进行薄层色谱检测，即得甘草苷对照品的薄层色谱。
44.优选地，每1ml对照品溶液中含0.5
‑
2mg甘草苷对照品。
45.本发明的另一个目的在于解决现有技术中四妙勇安汤或者其复方制剂中的金银花成分无法快速、准确鉴别的缺陷。
46.为此，本发明还提供了一种鉴定金银花成分的方法，包括将待测四妙勇安汤供试品的薄层色谱与对照品的薄层色谱比较的步骤；和/或，将待测四妙勇安汤供试品的薄层色谱与对照药材的薄层色谱比较的步骤。
47.其中，所述待测四妙勇安汤供试品的薄层色谱为使用待测四妙勇安汤供试品并且按照本发明任一所述的构建方法得到。
48.所述对照药材的薄层色谱为采用金银花药材代替四妙勇安汤供试品并且按照本发明任一所述的构建方法得到。也就是说，采用金银花药材按照本发明供试品溶液的制备方法同法制备金银花对照药材溶液。然后取金银花对照药材溶液按照本发明任一所述的构建方法进行薄层色谱检测，即得金银花对照药材的薄层色谱。
49.所述对照品的薄层色谱为采用用绿原酸、3,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸、4,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸中的至少一种制对照品成对照品溶液并且按照本发明任一所述的构建方法进行薄层色谱检测，即得绿原酸的薄层色谱和/或3,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸的薄层色谱和/或4,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸的薄层色谱。
50.优选地，每1ml各对照品溶液中含0.5
‑
2mg相应的对照品。
51.本发明还提供了本发明的同时鉴定金银花和甘草成分的方法或者所述的鉴定甘
草成分的方法或者所述的鉴定金银花成分的方法在四妙勇安汤或者四妙勇安汤复方制剂质量检测中的应用。
52.本发明还提供了一种中药产品的质量检测方法，
53.包括将四妙勇安汤或者四妙勇安汤复方制剂按照所述的同时鉴定金银花和甘草成分的方法鉴定金银花和甘草成分的步骤；和/或，
54.包括将四妙勇安汤或者四妙勇安汤复方制剂按照本发明的鉴定甘草成分的方法鉴定甘草成分的步骤；和/或，
55.包括将四妙勇安汤或者四妙勇安汤复方制剂按照本发明的鉴定金银花成分的方法鉴定金银花成分的步骤。
56.本发明技术方案，具有如下优点：
57.1.本发明提供的薄层色谱的构建方法，包括四妙勇安汤供试品溶液的制备，以及对该供试品溶液进行薄层色谱检测，即得供试品的薄层色谱，供试品溶液的制备方法包括，取四妙勇安汤供试品、水与正丁醇混合，固液分离，取液体，即得。使用上述制备方法不仅操作步骤简便，耗时短，溶剂种类且用量少，节约成本、易于推广应用；而且供试品溶液中的甘草成分和金银花成分很好的分离，使得薄层检测中斑点分离效果好，清晰，用于同时鉴定金银花和甘草成分时，使得鉴别过程更加快速方便、鉴别结果更加准确可靠。
58.2.本发明提供的薄层色谱的构建方法，结合采用本发明的乙酸丁酯
‑
甲酸
‑
水的上层液为展开剂，斑点分离效果更好，更加清晰，尤其是采用体积比为5
‑
10：2.5：2.5
‑
7.5的乙酸丁酯
‑
甲酸
‑
水的上层液为展开剂，在该特定体积配比下的展开剂能够同时将四妙勇安汤供试品溶液中的甘草成分和金银花成分很好的展开，分离度高，斑点多且清晰不聚集，色谱信息全面，且不受无阴性干扰，因此，制得的薄层色谱可用于同时鉴别甘草成分和金银花成分，使得鉴别过程快速方便、鉴别结果准确可靠。
59.3.本发明提供的薄层色谱的构建方法，薄层色谱检测中，在薄层板上点样供试品溶液，采用的薄层板为硅胶g薄层板，价格低廉，性能好，优选的，薄层板的长度≥10cm，能够提高样品的分离度。
60.4.本发明提供的薄层色谱的构建方法，采用香草醛硫酸溶液或者硫酸乙醇溶液为显色剂对展开后的薄层板进行显色能够使特征斑点颜色更加明显，易于待检测成分同其他成分区分，专属性强。
61.5.本发明提供的薄层色谱的构建方法，尤其是控制所述四妙勇安汤供试品的质量与水、正丁醇的体积之比为0.5
‑
1.5：5
‑
15：5；或者，采用离心的方式进行固液分离，并控制离心的时间为5
‑
10min，转速为2000
‑
4000转/分钟，或采用过滤的方式进行固液分离，并在过滤之前超声5
‑
20分钟，鉴别过程更加快速方便、鉴别结果更加准确可靠。
62.6.本发明提供的薄层色谱，供试品色谱中，有4个与甘草对照药材色谱相应位置颜色相同的斑点，有4个与金银花对照药材色谱相应位置颜色相同的斑点；有4个与对照品色谱相应位置颜色相同的斑点，因此可以准确达到对金银花、甘草的同时鉴别，同时供试品色谱中展现出的斑点可以对四妙勇安汤物质基准实物的优劣真伪进行鉴别。
63.7.本发明提供的同时鉴定金银花和甘草成分的方法，本发明采用的薄层色谱方法可以同时对四妙勇安汤物质基准实物中金银花、甘草成分进行鉴别，在同一供试品制备方法下，同一薄层色谱条件展开，实现了同时鉴别处方中金银花和甘草成分的目的，鉴别过程
快速方便、鉴别结果准确可靠。
64.优选的，鉴于金银花为四妙勇安汤中的君药，其中化学成分较多，通过单一的对照品难以鉴别供试品的优劣，本发明对照品的选择全面，以绿原酸、3,5
‑
二
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o
‑
咖啡酰奎宁酸、4,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸对照品作为金银花薄层鉴别的对照品；以甘草苷作为甘草薄层鉴别的对照品，色谱信息更加全面，特征斑点多而清晰，弥补了四妙勇安汤物质基准实物薄层鉴别技术领域的一项空缺，可作为一种快速、便捷同时鉴别四妙勇安汤物质基准实物鉴别的方法。
65.8.本发明提供的鉴定甘草成分的方法，待测四妙勇安汤供试品制备供试品溶液，对供试品溶液进行薄层色谱检测，即得供试品的薄层色谱，供试品溶液的制备方法包括，取四妙勇安汤供试品、水与正丁醇混合，固液分离，取液体，即得。该方法能够将四妙勇安汤供试品溶液中的甘草成分很好的分离，分离度高，斑点多且清晰不聚集，色谱信息全面，且不受无阴性干扰，因此，制得的薄层色谱可用于鉴别甘草成分。而且可采用更加简单的制备方法制备供试品溶液，使得供试品溶液的制备不仅操作步骤简便，耗时短，溶剂种类且用量少，节约成本、易于推广应用。
66.9.本发明提供的鉴定金银花成分的方法，待测四妙勇安汤供试品制备供试品溶液，对供试品溶液进行薄层色谱检测，即得供试品的薄层色谱，供试品溶液的制备方法包括，取四妙勇安汤供试品、水与正丁醇混合，固液分离，取液体，即得。该方法能够将四妙勇安汤供试品溶液中的金银花成分很好的分离，分离度高，斑点多且清晰不聚集，色谱信息全面，且不受阴性干扰，因此，制得的薄层色谱可用于鉴别金银花成分。而且可采用更加简单的制备方法制备供试品溶液，使得供试品溶液的制备不仅操作步骤简便，耗时短，溶剂种类且用量少，节约成本、易于推广应用。
附图说明
67.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
68.图1是实施例1的薄层色谱图；
69.图2是实施例2的薄层色谱图；
70.图3是实施例3的薄层色谱图；
71.图4是实施例4的薄层色谱图；
72.图5是实施例5的薄层色谱图；
73.图6是实施例6的薄层色谱图；
74.图7是实验例1第1项筛选的薄层色谱图；
75.图8是实验例1第2项筛选的薄层色谱图；
76.图9是实施例2中的不同称样量的薄层色谱图；
77.图10是实施例2中的不同点样量的薄层色谱图；
78.图11为实施例2中温度为20.3℃，湿度为37％的薄层色谱图；
79.图12为实施例2中温度为20.3℃，湿度为15％的薄层色谱图；
80.图13为实施例2中温度为20.3℃，湿度为83％的薄层色谱图；
81.图14为实施例2中温度为5.5℃，湿度为45％的薄层色谱图；
82.图15为烟台市化学工业研究所硅胶g薄层板的薄层色谱图；
83.图16为烟台市芝罘黄务硅胶开发试验厂硅胶g薄层板的薄层色谱图；
84.图17为merck kgaa生产的硅胶g薄层板的薄层色谱图；
85.图18为5wt％的香草醛硫酸溶液为显色剂的薄层色谱图；
86.图19为10vt％硫酸乙醇溶液为显色剂的薄层色谱图；
87.图20为最开始点样绿原酸、3,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸、4,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸对照品的薄层色谱图；
88.图21为最后点样绿原酸、3,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸、4,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸对照品的薄层色谱图；
89.图22是对比例1的薄层色谱图；
90.图23是对比例2的薄层色谱图；
91.图24是对比例3的薄层色谱图；
92.图25是对比例4的薄层色谱图；
93.图26是对比例5的薄层色谱图；
94.图27是对比例6的薄层色谱图；
95.图28是对比例7的薄层色谱图；
96.图29是对比例8的薄层色谱图。
具体实施方式
97.提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
98.实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
99.其中，下面各实施例、实验例和对比例中的四妙勇安汤物质基准实物、金银花单阴性冻干粉、甘草单阴性冻干粉、金银花单阳性冻干粉、甘草单阳性冻干粉的制备方法如下：
100.(1)四妙勇安汤标准汤剂的制备：分别按照金银花、玄参、当归与甘草的质量比为3：3：2：1称取金银花、玄参、当归与甘草饮片，加14倍量水，浸泡30min，武火煮沸，文火煎煮30min，过滤；再加12倍量水，武火煮沸，文火煎煮20min，过滤，药液合并，冷却至室温，即得。
101.(2)四妙勇安汤物质基准实物粉末的制备：取方法(1)中制得的四妙勇安汤标准汤剂，过滤，干燥，即得。
102.(3)四妙勇安汤的复方制剂的制备：取方法(1)中制得的四妙勇安汤标准汤剂，过滤，干燥，加入或不加入辅料，按照药学常规工艺，制得复方制剂。
103.(4)金银花单阴性冻干粉的制备：金银花单阴性冻干粉与四妙勇安汤物质基准实物的区别仅在于不添加金银花，其余原料和步骤参数均相同，具体制备方法包括如下步骤：
分别按照玄参、当归与甘草的质量比为3：2：1称取玄参、当归与甘草饮片，加14倍量水，浸泡30min，武火煮沸，文火煎煮30min，过滤；再加12倍量水，武火煮沸，文火煎煮20min，过滤，药液合并，冷却至室温，过滤，干燥，即得。
104.(5)甘草单阴性冻干粉的制备：甘草单阴性冻干粉与四妙勇安汤物质基准实物的区别仅在于不添加甘草，其余原料和步骤参数均相同，具体制备方法包括如下步骤：分别按照金银花、玄参与当归的质量比为3：3：2称取金银花、玄参与当归饮片，加14倍量水，浸泡30min，武火煮沸，文火煎煮30min，过滤；再加12倍量水，武火煮沸，文火煎煮20min，过滤，药液合并，冷却至室温，过滤，干燥，即得。
105.(6)金银花单阳性冻干粉的制备：金银花单阳性冻干粉与四妙勇安汤物质基准实物的区别仅在于只添加金银花，其余原料中药不添加，步骤参数均相同，具体制备方法包括如下步骤：称取金银花饮片，加14倍水，浸泡30min，武火煮沸，文火煎煮30min，过滤；再加12倍水，武火煮沸，文火煎煮20min，过滤，药液合并，冷却至室温，过滤，干燥。
106.(7)甘草单阳性冻干粉的制备：甘草单阳性冻干粉与四妙勇安汤物质基准实物的区别仅在于只添加金银花，其余原料中药不添加，步骤参数均相同，具体制备方法包括如下步骤：只称取甘草饮片，加14倍量水，浸泡30min，武火煮沸，文火煎煮30min，过滤；再加12倍量水，武火煮沸，文火煎煮20min，过滤，药液合并，冷却至室温，过滤，干燥。
107.其中，倍量指的是指每克药材中加入水的毫升数。
108.实施例1
109.本实施例提供了一种同时鉴定四妙勇安汤物质基准中金银花和甘草成分的方法，包括如下步骤：
110.(1)供试品溶液的制备：取四妙勇安汤物质基准实物粉末1g，加5ml水，加正丁醇5ml，离心(转速：3000转/分钟，时间：5分钟)，取上清液为供试品溶液。
111.(2)对照药材溶液的制备：分别取金银花对照药材0.5g、甘草对照药材1g，加5ml水，加正丁醇5ml，离心(转速：3000转/分钟，时间：5分钟)，取上清液分别为金银花对照药材溶液和甘草对照药材溶液。
112.(3)对照品溶液的制备：取绿原酸、3,5
‑
二
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o
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咖啡酰奎宁酸、4,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸、甘草苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg相应对照品的溶液，分别作为绿原酸对照品溶液、3,5
‑
二
‑
o
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咖啡酰奎宁酸对照品溶液和4,5
‑
二
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o
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咖啡酰奎宁酸、甘草苷对照品溶液。
113.(4)阴性对照溶液的制备，取金银花单阴性冻干粉1g、甘草单阴性冻干粉1g，分别加5ml水，加正丁醇5ml，离心(转速：3000转/分钟，时间：5分钟)，取上清液分别为金银花阴性对照溶液和甘草阴性对照溶液。
114.(5)薄层色谱检测：吸取供试品溶液、对照品溶液、对照药材溶液和阴性对照溶液各3μl，分别点于同一块硅胶g薄层板上，以乙酸丁酯
‑
甲酸
‑
水(体积比为7：2.5：2.5)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以质量百分数为2％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，在紫外灯365nm下检视。结果见图1。
115.其中编号1和5为供试品色谱；2为甘草阴性对照色谱；3为甘草苷对照品色谱；4为甘草对照药材色谱；6为金银花阴性对照色谱；7为绿原酸对照品色谱；8为3,5
‑
二
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o
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咖啡酰奎宁酸对照品色谱；9为4,5
‑
二
‑
o
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咖啡酰奎宁酸对照品色谱；10为金银花对照药材色谱。
116.比较可知，供试品色谱可见与甘草苷对照品色谱相应位置颜色相同的斑点，比移
值rf为0.31，符合薄层鉴别要求；与甘草对照药材色谱相应位置有4个颜色一致，阴性对照色谱无干扰的斑点。供试品与绿原酸、3，5
‑
o
‑
二咖啡酰基奎宁酸、4，5
‑
o
‑
二咖啡酰基奎宁酸相应位置显相同颜色的斑点，比移值rf分别为0.25、0.57、0.50，符合薄层鉴别要求；与金银花对照药材色谱的相应位置有4个颜色一致，阴性对照色谱无干扰的斑点。
117.实施例2
118.本实施例提供了一种同时鉴定四妙勇安汤物质基准中金银花和甘草成分的方法，包括如下步骤：
119.(1)供试品溶液的制备方法：取四妙勇安汤物质基准实物粉末1.5g，加5ml水，加正丁醇5ml，离心(转速：3000转/分钟，时间：5分钟)，取上清液为供试品溶液。
120.(2)对照药材溶液的制备方法：分别取金银花对照药材0.5g、甘草对照药材1g，加5ml水，加正丁醇5ml，离心(转速：3000转/分钟，时间：5分钟)，取上清液分别为金银花对照药材溶液和甘草对照药材溶液。
121.(3)对照品溶液的制备方法：取绿原酸、3,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸、4,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸、甘草苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg相应对照品的溶液，分别作为绿原酸对照品溶液、3,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸对照品溶液和4,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸、甘草苷对照品溶液。
122.(4)薄层色谱检测：吸取供试品溶液、对照品溶液、对照药材溶液各3μl，分别点于同一块硅胶g薄层板上，以乙酸丁酯
‑
甲酸
‑
水(体积比为7：2.5：2.5)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以质量百分数为2％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，在紫外灯365nm下检视。结果见图2。
123.其中编号1为供试品色谱；2为甘草苷对照品色谱；3为甘草对照药材色谱4为绿原酸对照品色谱；5为3,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸对照品色谱；6为4,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸对照品色谱；7为金银花对照药材色谱。
124.比较可知，供试品色谱可见与甘草苷对照品色谱相应位置颜色相同且无阴性干扰的斑点。供试品色谱与绿原酸、3，5
‑
o
‑
二咖啡酰基奎宁酸、4，5
‑
o
‑
二咖啡酰基奎宁酸相应位置显相同颜色且无阴性干扰的斑点。
125.实施例3
126.本实施例提供了一种鉴定四妙勇安汤物质基准中金银花成分的方法，包括如下步骤：
127.(1)供试品溶液的制备：取四妙勇安汤物质基准实物粉末1g，加5ml水，加正丁醇5ml，离心(转速：3000转/分钟，时间：5分钟)，取上清液为供试品溶液。
128.(2)对照药材溶液的制备：取金银花对照药材0.5g，加5ml水，加正丁醇5ml，离心(转速：3000转/分钟，时间：5分钟)，取上清液为金银花对照药材溶液。
129.(3)对照品溶液的制备：取绿原酸、3,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸对照品，加甲醇制成每1ml含1mg相应对照品的溶液，分别作为绿原酸对照品溶液、3,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸对照品溶液。
130.(4)薄层色谱检测：吸取供试品溶液、对照品溶液、对照药材溶液各3μl，分别点于同一块硅胶g薄层板上，以乙酸丁酯
‑
甲酸
‑
水(体积比为7：2.5：2.5)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以质量百分数为2％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，在
紫外灯365nm下检视。结果见图3。
131.其中编号1为供试品色谱；2为绿原酸对照色谱；3为3,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸对照色谱；4为金银花对照药材色谱。
132.比较可知，供试品色谱可见与绿原酸对照色谱和3,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸对照色谱相应位置颜色相同的斑点；与金银花对照药材色谱相应位置有4个颜色一致的斑点。
133.实施例4
134.本实施例提供了一种同时鉴定四妙勇安汤物质基准实物中金银花和甘草成分的方法，包括如下步骤：
135.(1)供试品溶液的制备：取四妙勇安汤物质基准实物粉末1g，加5ml水，加正丁醇5ml，离心(转速：3000转/分钟，时间：5分钟)，取上清液为供试品溶液。
136.(2)对照药材溶液的制备：分别取金银花对照药材0.5g、甘草对照药材1g，加5ml水，加正丁醇5ml，离心(转速：3000转/分钟，时间：5分钟)，取上清液分别为金银花对照药材溶液和甘草对照药材溶液。
137.(3)对照品溶液的制备：取甘草苷、绿原酸、3,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸、4,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸对照品，加甲醇制成每1ml含1mg相应对照品的溶液，分别作为甘草苷对照品溶液、绿原酸对照品溶液、3,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸对照品溶液和4,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸对照品溶液。
138.(4)薄层色谱检测：吸取供试品溶液、对照品溶液、对照药材溶液和阴性对照溶液各5μl，分别点于同一块硅胶g薄层板上，以乙酸丁酯
‑
甲酸
‑
水(体积比为5：2.5：2.5)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2wt％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，在紫外灯365nm下检视。结果见图4。
139.其中编号1为绿原酸对照品色谱；2为3,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸对照品色谱，3为4,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸对照品色谱；4为金银花对照药材色谱；5为供试品色谱；6为甘草对照药材色谱；7为甘草苷对照品色谱。
140.比较可知，在该展开剂条件下，供试品色谱斑点与各对照品色谱相应位置显颜色相同的斑点，并且分离效果好，与本技术实施例1能保持一致的试验结果。
141.实施例5
142.本实施例提供了一种同时鉴定金银花和甘草成分的方法，包括如下步骤：
143.(1)供试品溶液的制备：取四妙勇安汤物质基准实物粉末1g，加5ml水，加正丁醇5ml，离心(转速：3000转/分钟，时间：5分钟)，取上清液为供试品溶液。
144.(2)对照药材溶液的制备：分别取金银花对照药材0.5g、甘草对照药材1g，加5ml水，加正丁醇5ml，离心(转速：3000转/分钟，时间：5分钟)，取上清液分别为金银花对照药材溶液和甘草对照药材溶液。
145.(3)对照品溶液的制备：取甘草苷、绿原酸、3,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸、4,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸对照品，加甲醇制成每1ml含1mg相应对照品的溶液，分别作为甘草苷对照品溶液、绿原酸对照品溶液、3,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸对照品溶液和4,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸对照品溶液。
146.(4)薄层色谱检测：吸取供试品溶液、对照品溶液、对照药材溶液和阴性对照溶液各5μl，分别点于同一块硅胶g薄层板上，以乙酸丁酯
‑
甲酸
‑
水(体积比为10：2.5：2.5)的上
层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2wt％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，在紫外灯365nm下检视。结果见图5。
147.其中编号1为绿原酸对照品色谱；2为3,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸对照品色谱，3为4,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸对照品色谱；4为金银花对照药材色谱；5为供试品色谱；6为甘草对照药材色谱；7为甘草苷对照品色谱。
148.比较可知，在该展开剂条件下，供试品色谱斑点与各对照品色谱相应位置显颜色相同的斑点，并且分离效果好，与本技术实施例1能保持一致的试验结果。
149.实施例6
150.本实施例提供了一种同时鉴定金银花和甘草成分的方法，包括如下步骤：
151.(1)供试品溶液的制备：取四妙勇安汤物质基准实物粉末1g，加15ml水，加正丁醇5ml，离心(转速：3000转/分钟，时间：5分钟)，取上清液为供试品溶液。
152.(2)对照药材溶液的制备：分别取金银花对照药材0.5g、甘草对照药材1g，加15ml水，加正丁醇5ml，离心(转速：3000转/分钟，时间：5分钟)，取上清液分别为金银花对照药材溶液和甘草对照药材溶液。
153.(3)对照品溶液的制备：取绿原酸、3,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸、4,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸、甘草苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg相应对照品的溶液，分别作为绿原酸对照品溶液、3,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸对照品溶液和4,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸、甘草苷对照品溶液。
154.(4)阴性对照溶液的制备，取金银花单阴性冻干粉1g、甘草单阴性冻干粉1g，分别加15ml水，加正丁醇5ml，离心(转速：3000转/分钟，时间：5分钟)，取上清液分别为金银花阴性对照溶液和甘草阴性对照溶液。
155.(5)薄层色谱检测：吸取供试品溶液、对照品溶液、对照药材溶液和阴性对照溶液各3μl，分别点于同一块硅胶g薄层板上，以乙酸丁酯
‑
甲酸
‑
水(体积比为7：2.5：2.5)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以质量百分数为2％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，在紫外灯365nm下检视。结果见图6。
156.其中编号1为绿原酸对照品色谱；2为3,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸对照品色谱；3为4,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸对照品色谱；4为金银花对照药材色谱；5为供试品色谱；6为甘草对照药材色谱；7为甘草苷对照品色谱。
157.比较可知，在该展开剂条件下，供试品色谱斑点与各对照品色谱相应位置显颜色相同的斑点，并且分离效果好，与本技术实施例1能保持一致的试验结果。
158.实验例1对照品的筛选
159.1、甘草成分对照品的筛选：
160.(1)供试品溶液的制备：取四妙勇安汤物质基准实物粉末1g，加5ml水，加正丁醇5ml，离心(转速：3000转/分钟，时间：5分钟)，取上清液为供试品溶液。
161.(2)对照药材溶液的制备：分别取甘草对照药材1g，加5ml水，加正丁醇5ml，离心(转速：3000转/分钟，时间：5分钟)，取上清液为甘草对照药材溶液。
162.(3)对照品溶液的制备：取甘草苷、甘草查尔酮b、甘草素、异甘草苷、异甘草素、甘草查尔酮a、刺甘草查尔酮、甘草酸铵对照品，加甲醇制成每1ml含1mg相应对照品的溶液，分别作为对照品溶液。
163.(4)阴性对照溶液的制备，取甘草单阴性冻干粉1g，加5ml水，加正丁醇5ml，离心
(转速：3000转/分钟，时间：5分钟)，取上清液为甘草阴性对照溶液。
164.(5)薄层色谱检测：吸取供试品溶液、对照品溶液、对照药材溶液和阴性对照溶液各5μl，分别点于同一块硅胶g薄层板上，以乙酸丁酯
‑
甲酸
‑
水(体积比为7：2.5：2.5)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以质量百分数为2％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，在紫外灯365nm下检视。结果见图7。
165.编号1为供试品色谱图；2为甘草阴性对照色谱图；3为甘草苷对照品色谱图；4为甘草查尔酮b色谱图；5为甘草素色谱图；6为异甘草苷色谱图；7为异甘草素色谱图；8为甘草查尔酮a色谱图；9为刺甘草查尔酮色谱图；10为甘草酸铵色谱图；11为甘草对照药材色谱图。
166.比较可知，在甘草鉴别方法中，以上7个对照品中只有甘草苷一个对照品能够满足与对照品色谱相应位置颜色一致并且阴性无干扰的对照品。因此选择甘草苷作为鉴定甘草成分的对照品。
167.2、甘草酸铵与甘草苷对照品的筛选
168.(1)供试品溶液的制备：取四妙勇安汤物质基准实物粉末1g，加乙醚20ml，超声30分钟，滤过，弃去醚液，药渣加甲醇20ml，超声30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水40ml使溶解，用正丁醇提取3次，每次15ml，合并正丁醇液，用水洗涤3次，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，取上清液为供试品溶液。
169.(2)对照药材溶液的制备：分别取甘草对照药材1g，同供试品溶液的制备方法制备成甘草对照药材溶液。
170.(3)对照品溶液的制备：取甘草苷、甘草酸铵对照品，加甲醇制成每1ml含1mg相应对照品的溶液，分别作为甘草苷对照品溶液、甘草酸铵对照品溶液。
171.(4)阴性对照溶液的制备，取甘草单阴性冻干粉1g，同供试品溶液的制备方法制备成甘草阴性对照溶液。
172.(5)薄层色谱检测：吸取供试品溶液、对照品溶液、对照药材溶液和阴性对照溶液各10μl，分别点于同一块硅胶g薄层板上，以乙酸丁酯
‑
甲酸
‑
水(体积比为7：2.5：2.5)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以质量百分数为2％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，在紫外灯365nm下检视。结果见图8。
173.其中编号1为供试品色谱；编号2为甘草阴性对照色谱；3为甘草苷对照色谱；4为甘草酸铵对照色谱；5为甘草对照药材色谱。
174.供试品色谱可见与甘草苷对照色谱相应位置颜色相同的斑点；与甘草对照药材色谱相应位置有3个颜色一致的斑点，本方法对甘草酸铵不适用，供试品色谱中与甘草酸铵色谱相应位置分离较差。
175.实验例2方法学验证
176.1、仪器、试剂与试药
177.仪器：goodlook
‑
1000薄层色谱成像系统(上海科哲生化科技有限公司)、jj500电子天平(常熟市双杰测试仪器厂)、msa66s0ce
‑
dm电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)、td
‑
5m离心机(四川蜀科仪器有限公司)；
178.薄层板商品名：硅胶g薄层板，厂家：烟台市化学工业研究所；规格：100*200cm；型号：hsg；批号：20190808。
179.薄层板商品名：薄层层析硅胶板，厂家：烟台市芝罘黄务硅胶开发试验厂；规格：10
×
20cm，型号：hsg，批号：2016年10月07日。
180.薄层板商品名：tlc silica gel 60，厂家：merck kgaa，规格：20
×
20cm，型号：aluminium sheets，批号：hx084531。
181.试剂：正丁醇、乙酸丁酯、甲酸、蒸馏水均为分析纯。
182.试药：金银花对照药材、甘草对照药材、甘草苷、绿原酸、3,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸、4,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸等对照品均由中国食品药品检定研究院提供。四妙勇安汤物质基准实物、四妙勇安汤金银花阴性冻干粉、四妙勇安汤甘草阴性冻干粉均为自制。
183.2、溶液的制备
184.供试品溶液制备：取四妙勇安汤物质基准实物粉末1g，加5ml水，加正丁醇5ml，离心，取上清液作为供试品溶液。
185.对照药材溶液制备：分别取金银花对照药材0.5g、甘草对照药材1g，加5ml水，加正丁醇5ml，离心，取上清液作为对照药材溶液。
186.对照品溶液制备：取绿原酸、3,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸、4,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸、甘草苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。
187.3、薄层色谱条件
188.薄层板：硅胶g板；
189.展开剂：乙酸丁酯
‑
甲酸
‑
水(7：2.5：2.5)的上层溶液为展开剂；
190.显色：喷以2wt％香草醛硫酸溶液，并在105℃加热至斑点清晰；
191.检视：在紫外灯365nm下检视。
192.4、不同称样量的考察
193.按本实验例第2项制备对照药材溶液和对照品溶液，分别称取四妙勇安汤物质基准实物0.5g、1g、1.5g，其余按本实验例第2项下方法制备各供试品溶液。鉴于甘草对照药材、金银花对照药材色谱斑点清晰，用量合理，因此不对对照药材进行称样量的考察。
194.吸取各供试品溶液、对照药材溶液、对照品溶液3μl，分别点样于同一硅胶g薄层板上，以乙酸丁酯
‑
甲酸
‑
水(7：2.5：2.5)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2wt％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视。结果见图9。
195.编号1为供试品0.5g色谱图；2为供试品1g色谱图；3为供试品1.5g色谱图；4为甘草苷色谱图；5为甘草对照药材色谱图。
196.小结：通过对称样量的考察，供试品称样量为1g时，薄层色谱斑点清晰，斑点大小适中，分离度佳，rf适中。
197.5、不同点样量考察
198.按本实验例第2项制备供试品溶液、对照药材溶液和对照品溶液，吸取各供试品溶液、对照药材溶液各2μl、3μl、4μl和5μl，吸取各对照品溶液3μl，分别点样于同一硅胶g薄层板上，按本实验例第3项下操作，结果见图10。
199.编号1为供试品2μl色谱图；2为供试品3μl色谱图；3为供试品4μl色谱图；4为供试品5μl色谱图；5为甘草苷色谱图；6为甘草对照药材2μl色谱图；7为甘草对照药材3μl色谱图；8为甘草对照药材4μl色谱图；9为甘草对照药材5μl色谱图；10为绿原酸色谱图；11为3,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸色谱图；12为4,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸色谱图；13为金银花对照药材2μl色谱图；14为金银花对照药材3μl色谱图；15为金银花对照药材4μl色谱图；16为金银花对
照药材5μl色谱图。
200.小结：由上图可知，通过对点样量的考察，供试品、甘草对照药材、金银花对照药材点样量为3～5μl，薄层色谱斑点清晰，斑点大小适中，分离度佳，rf适中。
201.6、不同温湿度考察
202.按本实验例第2项制备供试品溶液、对照药材溶液和对照品溶液，吸取各供试品溶液、对照药材溶液、对照品溶液3μl，分别点样于同一硅胶g薄层板上，分别考察5～35℃高低两个温度，15～35％、35～75％、75～90％高中低三个相对湿度条件下的展开情况，取出，晾干，其余均按本实验例第3项下操作。结果见图11
‑
14所示。
203.在图11
‑
14中，编号1为绿原酸色谱图；2为3,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸色谱图；3为4,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸色谱图；4为金银花对照药材色谱图；5为供试品色谱图；6为甘草对照药材色谱图；7为甘草苷色谱图。
204.小结：通过不同温湿度条件下供试品均能得到良好的分离效果，该薄层色谱鉴别方法对于不同温度和湿度有较好的耐用性。
205.7、不同薄层板考察
206.按本实验例第2项制备供试品溶液、对照药材溶液和对照品溶液，分别采用烟台市化学工业研究所、烟台市芝罘黄务硅胶开发试验厂、merck kgaa生产的硅胶g薄层板，吸取各供试品溶液、对照药材溶液、对照品溶液0.5～3μl，分别点样于上述三种薄层板上，分别按本实验例第3项下操作。结果见图15
‑
17所示。
207.在图15
‑
17中，编号1为绿原酸色谱图；2为3,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸色谱图；3为4,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸色谱图；4为金银花对照药材色谱图；5为供试品色谱图；6为甘草对照药材色谱图；7为甘草苷色谱图。
208.小结：不同厂家生产的硅胶g薄层板，对四妙勇安汤物质基准实物均能得到良好的分离效果，该薄层色谱鉴别方法对于不同厂家生产的薄层板有较好的耐用性。
209.8、不同显色剂考察
210.按本实验例第2项制备供试品溶液、对照药材溶液和对照品溶液，按本实验例第3项下操作进行薄层色谱检测。其中展开、晾干后分别以质量百分数为5％的香草醛硫酸溶液、体积百分数为10％的硫酸乙醇溶液为显色剂，分别喷以上述不同的显色剂后，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365nm)下检视。分别见图18
‑
19所示。
211.在图18
‑
19中，编号1为绿原酸色谱图；2为3,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸色谱图；3为4,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸色谱图；4为金银花对照药材色谱图；5为供试品色谱图；6为甘草对照药材色谱图；7为甘草苷色谱图。
212.小结：采用的显色剂2～5wt％香草醛硫酸溶液、10vt％硫酸乙醇溶液均可，能与本技术实施例1能保持一致的试验结果。
213.9、不同的点样顺序考察
214.按本实验例第2项制备供试品溶液、对照药材溶液和对照品溶液，按本实验例第3项下操作进行薄层色谱检测。在薄层板上点样时分别最开始点样绿原酸、3,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸、4,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸对照品溶液、最后点样绿原酸、3,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸、4,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸对照品溶液，其余均按本实验例第3项下操作。结果分别见图20
‑
21所示。
215.图20
‑
21中，编号1为绿原酸色谱图；2为3，5
‑
o
‑
二咖啡酰基奎宁酸色谱图；3为4，5
‑
o
‑
二咖啡酰基奎宁酸色谱图；4为金银花对照药材色谱图；5～19为供试品色谱图；20为甘草对照药材色谱图；21为甘草苷色谱图。
216.小结：绿原酸、3,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸、4,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸对照品是最开始点样的，可以看出，三者均出现多个斑点，导致对照品分解，因此建议最后点样或以玻璃板覆盖保护。
217.对比例1
218.本对比例提供了一种四妙勇安汤物质基准实物中金银花成分的鉴定方法，包括如下步骤：
219.(1)供试品溶液的制备方法：取四妙勇安汤物质基准实物粉末1g，加甲醇15ml，超声处理10分钟，滤过，滤液蒸干，残渣用水10ml溶解，转移至分液漏斗中，用乙醚振摇提取2次，每次10ml，再用水饱和的正丁醇10ml振摇提取，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇lml使溶解，作为供试品溶液。
220.(2)金银花对照药材溶液和金银花阴性对照溶液的制备方法：取金银花对照药材0.5g和金银花单阴性冻干粉1g，分别加甲醇15ml，超声处理10分钟，滤过，滤液蒸干，残渣用水10ml溶解，转移至分液漏斗中，用乙醚振摇提取2次，每次10ml，再用水饱和的正丁醇10ml振摇提取，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇lml使溶解，分别得到为金银花对照药材溶液和金银花阴性对照溶液。
221.(3)对照品溶液的制备方法：取绿原酸、3,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸对照品，加甲醇制成每1ml含1mg相应对照品的溶液，分别作为绿原酸对照品溶液和3,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸对照品溶液。
222.(4)薄层色谱检测：吸取供试品溶液、对照品溶液、金银花对照药材溶液、金银花阴性对照溶液各3μl，分别点于同一块硅胶g薄层板上，以乙酸丁酯
‑
甲酸
‑
水(体积比为7：2.5：2.5)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2wt％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，在紫外灯365nm下检视。结果见图22。
223.其中编号1为供试品色谱；2为金银花阴性对照色谱；3为绿原酸色谱；4为3，5
‑
o
‑
二咖啡酰基奎宁酸色谱；5为金银花对照药材色谱。
224.比较可知，在供试品色谱中，与绿原酸、3，5
‑
o
‑
二咖啡酰基奎宁酸对照品相应位置，未显相同颜色的斑点，供试品色谱存在拖尾现象，分离较差。因此，该方法不能作为四妙勇安汤物质基准实物金银花的鉴别方法。
225.对比例2
226.本对比例提供了一种四妙勇安汤物质基准实物中金银花成分的鉴定方法，包括如下步骤：
227.(1)供试品溶液的制备方法：取四妙勇安汤物质基准实物粉末1g，加水15ml，超声10分钟，过滤，滤液置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次10ml，合并正丁醇提取液，水浴蒸干，残渣加2ml甲醇使溶解，作为供试品溶液。
228.(2)金银花对照药材溶液和金银花阴性对照溶液的制备方法：取金银花对照药材0.5g和金银花单阴性冻干粉1g，分别加水15ml，超声10分钟，过滤，滤液置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次10ml，合并正丁醇提取液，水浴蒸干，残渣加2ml甲醇使溶
解，分别得到为金银花对照药材溶液和金银花阴性对照溶液。
229.(3)对照品溶液的制备方法：取绿原酸、3,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸对照品，加甲醇制成每1ml含1mg相应对照品的溶液，分别作为绿原酸对照品溶液和3,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸对照品溶液。
230.(4)薄层色谱检测：吸取供试品溶液、对照品溶液、金银花对照药材溶液、金银花阴性对照溶液各3μl，分别点于同一块硅胶g薄层板上，以乙酸丁酯
‑
甲酸
‑
水(体积比为7：2.5：2.5)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2wt％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，在紫外灯365nm下检视。结果见图23。
231.其中编号1为供试品色谱；2为金银花阴性对照色谱；3为绿原酸色谱；4为3，5
‑
o
‑
二咖啡酰基奎宁酸色谱；5为金银花对照药材色谱。
232.比较可知，在供试品色谱中，与绿原酸、3，5
‑
o
‑
二咖啡酰基奎宁酸对照品相应位置，未显相同颜色的斑点，供试品色谱存在拖尾现象，分离较差。因此，该方法不能作为四妙勇安汤物质基准实物金银花的鉴别方法。
233.对比例3
234.本对比例提供了一种同时鉴定四妙勇安汤物质基准实物中甘草成分的方法，包括如下步骤：
235.(1)供试品溶液的制备：取四妙勇安汤物质基准实物粉末1g，加水饱和的正丁醇30ml，超声20min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，为供试品溶液。
236.(2)对照药材溶液的制备：取甘草对照药材1g，加水饱和的正丁醇30ml，超声20min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，为甘草对照药材溶液。
237.(3)对照品溶液的制备：取甘草苷、甘草酸铵对照品，分别加甲醇制成每1ml含1mg相应对照品的溶液，分别作为甘草苷对照品溶液、甘草酸铵对照品溶液。
238.(4)阴性对照溶液的制备，取甘草单阴性冻干粉1g，加水饱和的正丁醇30ml，超声20min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，为甘草阴性对照溶液。
239.(5)薄层色谱检测：吸取供试品溶液、对照品溶液、对照药材溶液和阴性对照溶液各3μl，分别点于同一块硅胶g薄层板上，以乙酸丁酯
‑
甲酸
‑
水(体积比为7：2.5：2.5)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以质量百分数为2％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，在紫外灯365nm下检视。结果见图24。
240.其中编号1为甘草苷对照色谱；2为甘草酸铵对照色谱；3为供试品色谱；4为甘草阴性对照；5为甘草对照药材色谱。
241.比较可知，在供试品色谱中，供试品色谱斑点少且不清晰，色谱信息不全面，不能作为四妙勇安汤物质基准实物甘草鉴别的供试品制备方法。
242.对比例4
243.本实施例提供了一种同时鉴定四妙勇安汤物质基准实物中金银花和甘草成分的方法，包括如下步骤：
244.(1)供试品溶液的制备：取四妙勇安汤物质基准实物粉末1g，加5ml水，加正丁醇5ml，离心(转速：3000转/分钟，时间：5分钟)，取上清液为供试品溶液。
245.(2)对照药材溶液的制备：分别取金银花对照药材0.5g、甘草对照药材1g，加5ml水，加正丁醇5ml，离心(转速：3000转/分钟，时间：5分钟)，取上清液分别为金银花对照药材
溶液和甘草对照药材溶液。
246.(3)对照品溶液的制备：取甘草苷、绿原酸、3,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸、4,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸对照品，加甲醇制成每1ml含1mg相应对照品的溶液，分别作为甘草苷对照品溶液、绿原酸对照品溶液、3,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸对照品溶液和4,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸对照品溶液。
247.(4)阴性对照溶液的制备，取金银花单阴性冻干粉1g、甘草单阴性冻干粉1g，分别加5ml水，加正丁醇5ml，离心(转速：3000转/分钟，时间：5分钟)，取上清液分别为金银花阴性对照溶液和甘草阴性对照溶液。
248.(5)薄层色谱检测：吸取供试品溶液、对照品溶液、对照药材溶液和阴性对照溶液各3μl，分别点于同一块硅胶g薄层板上，以乙酸丁酯
‑
甲酸
‑
水(体积比为4：3：3)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，在紫外灯365nm下检视。结果见图25。
249.其中编号1为绿原酸对照品色谱；2为3,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸对照品色谱，3为4,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸对照品色谱；4为金银花对照药材色谱；5为金银花阴性对照色谱；6为供试品色谱；7为甘草阴性对照色谱；8为甘草对照药材色谱；9为甘草苷对照品色谱。
250.比较可知，该展开剂对甘草的鉴别无效，供试品色谱中，未显与甘草对照药材相应位置颜色一致的斑点，亦未显甘草苷对照药材，对比本技术方法，不能做到同时对金银花和甘草的同时鉴别。
251.对比例5
252.本实施例提供了一种同时鉴定金银花和甘草成分的方法，包括如下步骤：
253.(1)供试品溶液的制备：取四妙勇安汤物质基准实物粉末1g，加5ml水，加正丁醇5ml，离心(转速：3000转/分钟，时间：5分钟)，取上清液为供试品溶液。
254.(2)对照药材溶液的制备：分别取金银花对照药材0.5g、甘草对照药材1g，加5ml水，加正丁醇5ml，离心(转速：3000转/分钟，时间：5分钟)，取上清液分别为金银花对照药材溶液和甘草对照药材溶液。
255.(3)对照品溶液的制备：取甘草苷、绿原酸、3,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸、4,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸对照品，加甲醇制成每1ml含1mg相应对照品的溶液，分别作为甘草苷对照品溶液、绿原酸对照品溶液、3,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸对照品溶液和4,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸对照品溶液。
256.(4)阴性对照溶液的制备，取金银花单阴性冻干粉1g、甘草单阴性冻干粉1g，分别加5ml水，加正丁醇5ml，离心(转速：3000转/分钟，时间：5分钟)，取上清液分别为金银花阴性对照溶液和甘草阴性对照溶液。
257.(5)薄层色谱检测：吸取供试品溶液、对照品溶液、对照药材溶液和阴性对照溶液各3μl，分别点于同一块硅胶g薄层板上，以乙酸丁酯
‑
甲酸
‑
水(体积比为4：3：3)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2wt％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，在紫外灯365nm下检视。结果见图26。
258.其中编号1为绿原酸对照品色谱；2为3,5
‑
二
‑
o
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咖啡酰奎宁酸对照品色谱，3为4,5
‑
二
‑
o
‑
咖啡酰奎宁酸对照品色谱；4为金银花对照药材色谱；5为金银花阴性对照色谱；6为供试品色谱；7为甘草阴性对照色谱；8为甘草对照药材色谱；9为甘草苷对照品色谱。
259.比较可知，该展开剂对甘草的鉴别无效，使用该展开剂展开，显色后供试品分离效
果差，并且供试品色谱中，在与甘草对照药材相应位置存在阴性干扰(见色谱图中标注位置)。
260.对比例6
261.本对比例提供了一种鉴定四妙勇安汤物质基准实物中甘草成分的方法，包括如下步骤：
262.(1)供试品溶液的制备：取四妙勇安汤物质基准实物粉末1g，加5ml水，加正丁醇5ml，离心(转速：3000转/分钟，时间：5分钟)，取上清液为供试品溶液。
263.(2)对照药材溶液的制备：取甘草对照药材1g，加5ml水，加正丁醇5ml，离心(转速：3000转/分钟，时间：5分钟)，取上清液为甘草对照药材溶液。
264.(3)对照品溶液的制备：取甘草苷、甘草酸铵对照品，分别加甲醇制成每1ml含1mg相应对照品的溶液，分别作为甘草苷对照品溶液和甘草酸铵对照品溶液。
265.(4)阴性对照溶液的制备，取甘草单阴性冻干粉1g，加5ml水，加正丁醇5ml，离心(转速：3000转/分钟，时间：5分钟)，取上清液为甘草阴性对照溶液。
266.(5)薄层色谱检测：吸取供试品溶液、对照品溶液、对照药材溶液、阴性对照溶液各3μl，分别点于同一块硅胶g薄层板上，以乙酸乙酯
‑
甲酸
‑
冰醋酸
‑
水(体积比为15：1：1：2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2wt％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，在紫外灯365nm下检视。结果见图27。
267.其中编号1为供试品色谱；2为甘草阴性对照色谱；3为甘草苷对照色谱；4为甘草酸铵对照色谱；5为甘草对照药材色谱。
268.比较可知，在该展开剂条件下，供试品色谱斑点与甘草苷对照品色谱相应位置显颜色相同的斑点，但分离度较差，无法准确鉴别四妙勇安汤物质基准实物中是否存在甘草成分。
269.对比例7
270.本对比例提供了一种鉴定甘草成分的方法，包括如下步骤：
271.(1)供试品溶液的制备：取四妙勇安汤物质基准实物粉末1g，加5ml水，加正丁醇5ml，离心(转速：3000转/分钟，时间：5分钟)，取上清液为供试品溶液。
272.(2)对照药材溶液的制备：取甘草对照药材1g，加5ml水，加正丁醇5ml，离心(转速：3000转/分钟，时间：5分钟)，取上清液为甘草对照药材溶液。
273.(3)对照品溶液的制备：取甘草苷、甘草酸铵对照品，分别加甲醇制成每1ml含1mg相应对照品的溶液，分别作为甘草苷对照品溶液和甘草酸铵对照品溶液。
274.(4)阴性对照溶液的制备，取甘草单阴性冻干粉1g，加5ml水，加正丁醇5ml，离心(转速：3000转/分钟，时间：5分钟)，取上清液为甘草阴性对照溶液。
275.(5)薄层色谱检测：吸取供试品溶液、对照品溶液、对照药材溶液、阴性对照溶液各3μl，分别点于同一块硅胶g薄层板上，以乙酸乙酯
‑
甲醇
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水(体积比为20:3:2)，展开，取出，晾干，喷以2wt％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，在紫外灯365nm下检视。结果见图28。
276.其中编号1为供试品色谱；2为甘草阴性对照色谱；3为甘草苷对照色谱；4为甘草酸铵对照色谱；5为甘草对照药材色谱。
277.比较可知，在该展开剂条件下，供试品色谱斑点与甘草苷对照品色谱相应位置显
颜色相同的斑点，但供试品色谱与甘草对照药材色谱只有一个相应位置一致且无阴性干扰的斑点，且供试品存在拖尾现象，分离效果不好，无法准确鉴别四妙勇安汤物质基准实物中是否存在甘草成分。
278.对比例8
279.本对比例提供了一种鉴定甘草成分的方法，包括如下步骤：
280.(1)供试品溶液的制备：取四妙勇安汤物质基准实物粉末1g，加5ml水，加正丁醇5ml，离心(转速：3000转/分钟，时间：5分钟)，取上清液为供试品溶液。
281.(2)对照药材溶液的制备：取甘草对照药材1g，加5ml水，加正丁醇5ml，离心(转速：3000转/分钟，时间：5分钟)，取上清液为甘草对照药材溶液。
282.(3)对照品溶液的制备：取甘草苷、甘草酸铵对照品，分别加甲醇制成每1ml含1mg相应对照品的溶液，分别作为甘草苷对照品溶液和甘草酸铵对照品溶液。
283.(4)阴性对照溶液的制备，取甘草单阴性冻干粉1g，加5ml水，加正丁醇5ml，离心(转速：3000转/分钟，时间：5分钟)，取上清液为甘草阴性对照溶液。
284.(5)薄层色谱检测：吸取供试品溶液、对照品溶液、对照药材溶液、阴性对照溶液液各3μl，分别点于同一块硅胶g薄层板上，以正丁醇
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乙酸
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水(体积比为7:1:12)，展开，取出，晾干，喷以2wt％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，在紫外灯365nm下检视。结果见图29。
285.其中编号1为供试品色谱；2为甘草阴性对照色谱；3为甘草苷对照色谱；4为甘草酸铵对照色谱；5为甘草对照药材色谱。
286.比较可知，在该展开剂条件下，在该展开剂条件下，供试品色谱斑点存在拖尾现象，无法准确鉴别四妙勇安汤物质基准实物中是否存在甘草成分。
287.显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。