一种多囊卵巢综合征并发代谢综合征预测标记物及其应用

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及多囊卵巢综合征诊断检测用的生物标志物和试剂盒领域。

背景技术：

多囊卵巢综合征（polycysticovarysyndrome，pcos）是一种病因不明的复杂异质性疾病，是育龄女性中最常见的生殖内分泌疾病，是无排卵型不孕发生最主要的原因。由于该病诊断标准的不一致及种族差异，导致各国/地区不同研究报道的患病率存在较大差异，一般在5%~10%。根据国际较为广泛应用的鹿特丹诊断标准，2007年至2011年期间北京大学第三医院牵头的“十二五”国家科技支撑计划通过对来自中国10个省市的15924名19～45岁的育龄妇女进行大规模的分层随机抽样调查，发现中国育龄妇女中pcos患病率为5.6%，估计全国约有1500万患者。

除了育龄期的生殖障碍，pcos患者往往伴有长期、明显的代谢异常，包括肥胖、胰岛素抵抗、糖耐量受损、血脂异常等。pcos妇女中肥胖的发生率30%~60%，且与年龄和体重相匹配的对照人群相比，pcos患者更容易发生腹型肥胖，瘦型pcos患者也容易出现腹部脂肪堆积。pcos患者合并血脂异常的比例高达70%，主要表现为高密度脂蛋白（highdensitylipoprotein,hdl）降低，而低密度脂蛋白（lowdensitylipoprotein,ldl）、甘油三酯（triglyceride,tg）和胆固醇（totalcholesterol,t-cho）浓度升高。高胰岛素血症和胰岛素抵抗（insulinresistance,ir）是pcos患者的另一重要特征，pcos患者中合并ir的比例高达50%~70%，同时pcos患者糖耐量受损（impairedglucoseintolerance,igt）患病率为31%~35%，这些都远高于正常人群中的患病率。基于以上代谢问题，pcos患者发生代谢综合征（metabolicsyndrome，mets）的风险显著升高，同时mets发生又进一步增加远期ii型糖尿病和心脑血管疾病的发病风险。pcos被视为是mets的前兆，糖脂代谢异常是联系两者的桥梁。

代谢综合征是以中心性肥胖、高血压、高血脂和高血糖为特征的综合群。研究报道的pcos患者中代谢综合征的发生率及表型特点在不同种族人群中有所差异。美国地区pcos妇女中合并mets的发生率高达43-46%；在德国，31%pcos妇女发生mets，其最显著特征为向心性型肥胖；南亚pcos妇女发生mets比率为30.6%，而对照人群中只有6.34%；印度地区所报道的pcos妇女中合并mets的发生率为37.5%；在中国，西南部地区妇女中报道的mets的比例则为25.62%，香港地区pcos妇女中mets发生率为24.9%，显著高于对照人群中3.1%的mets发生率。本研究团队前期开展的中国10省市育龄妇女大规模随机抽样调查结果显示，pcos患者mets发生率为18.2%，且在40岁以上人群中，pcos患者中mets发生率增加至47.6%，明显高于对照组24.4%，这表明随着年龄升高，pcos患者发生mets的风险增加程度更为显著。因此，pcos不仅是育龄期生殖系统问题，作为一种长期代谢紊乱性疾病，pcos几乎影响女性一生健康，特别是长期生活质量，该疾病无法治愈，但可以通过监测及调整机体内分泌代谢紊乱状态，控制代谢疾病发生风险。

尽管目前临床越来越重视对pcos患者的代谢筛查，但由于mets临床表现多样，目前尚缺乏全球统一诊断标准，不同的学术机构不断提出、修订mets诊断标准，目前应用较为广泛的是2005年美国国家胆固醇教育计划(ncep)成人组修订的标准（atpⅲ2005），满足以下5项中3项及以上即可诊断为mets，针对华人女性指标分别为：①腰围>80cm；②甘油三酯(tg)1.7mmol/l(150mg/dl)，或已接受药物治疗；③高密度脂蛋白(hdl-c)<1.3mmol/l(50mg/dl)，或已接受药物治疗；④血压异常，收缩压130mmhg，或舒张压85mmhg；⑤空腹血糖(fpg)异常，fpg5.6mmol/l(100mg/dl)，或已接受药物治疗。以上临床常规检测指标较多，除了腰围、血压外，还包括空腹血糖、血脂（胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白）检测，且判断其是否发生mets的标准较为复杂，目前尚缺乏快速、便捷的代谢风险预测工具。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的问题，本发明应用靶向代谢组学方法进行pcos患者全谱氨基酸（50种）水平定量检测，筛选出能够检测多囊卵巢综合征患者是否发生代谢综合征的氨基酸标记物。基于回归模型构建风险评分工具，方便临床应用。

本发明的第一个方面，提供了一组可用于多囊卵巢综合征并发代谢综合征诊断的生物标志物，所述生物标志物包括至少8种特定氨基酸，所述特定氨基酸为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸。

在一种实施方案中，本发明生物标志物指受试体生物样本中存在的代谢物成分，受试体可以是人类或哺乳动物。生物样本可选自来源于受试体的血浆或血清。优选的，所述生物样本为血清。

本发明的第二个方面，提供将所述的生物标志物用于制备诊断或检测pcos患者并发代谢综合征的试剂盒的用途，所述试剂盒的使用方法包括，可通过测试受试体血浆或血清中代谢物的水平，任选地结合临床指标，诊断或检测pcos患者是否并发代谢综合征。

本发明的第三个方面，提供一种多囊卵巢综合征并发代谢综合征的诊断试剂盒，所述试剂盒包含用于定量检测生物标志物表达水平的试剂，所述生物标志物为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸。

在一种实施方案中，所述试剂盒的使用方法为利用质谱仪对受试者血液或血清中的生物标志物水平进行定量检测。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。

图1roc曲线分析。8aassignature,8种氨基酸（丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸）联合分析;wc,腰围;sbp,收缩压;fpg,空腹血糖;tg,甘油三酯水平。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如教科书和实验指南中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：差异性生物标志物的筛选

1.研究对象及样本采集

研究经北京大学第三医院伦理委员会批准，招募2017年10月至2018年12月就诊于北京大学第三医院生殖医学中心的女性患者。

1.1纳入和排除标准：

纳入标准：依据2003年鹿特丹pcos诊断标准选择入组人群，符合下列三项条件中的两项即可诊断为pcos：月经稀发和/或闭经、高雄激素血症或者高雄激素的临床表现（多毛、痤疮等）、超声下卵巢呈多囊样改变；同时排除引起高雄激素血症的其它原因。

排除标准：诊断为子宫肌瘤、子宫内膜异位症、生殖系统畸形和卵巢肿瘤的患者；诊断为甲状腺疾病、糖尿病和心血管疾病的患者。

所有入选对象3个月内无服用激素类药物的病史。

1.2入组患者检测指标：

基本指标：年龄、身高、体重、血压（收缩压、舒张压）、腰臀围等；

内分泌代谢指标：月经第3~5天抽血检测性激素水平（泌乳素、促卵泡刺激素fsh、黄体生成素lh、雌激素、孕酮、总睾酮t、雄烯二酮a）、性激素结合球蛋白shbg、抗苗勒试管激素amh；空腹血糖，糖耐量试验（ogtt），空腹胰岛素，胰岛素耐量试验（itt）；血脂（胆固醇，甘油三酯，低密度脂蛋白，高密度脂蛋白）等；

b超检测：在月经干净后的3~7天做超声检查卵巢卵泡数量及体积（有性生活经历的女性经阴道b超，无性生活经历的女性做经腹部或者经直肠b超检查），确定窦卵泡数（afc）。

2质谱检测全谱氨基酸水平

样本采集：采集患者空腹状态下静脉血1ml，3000rpm×10min离心后留取上清于-80℃冻存，用于质谱测定；由于氨基酸谱检测仅需要50微升血浆样本，因此留存患者临床常规检查剩余血样即可，避免重复取血。

主要仪器：高效液相色谱-四级杆离子阱串联质谱仪（hplc/q-trap-ms/ms，lc液相：美国戴安公司；质谱：美国ab公司）

检测方法：液相色谱采用的是梯度洗脱的方法，色谱柱选择mslab-aa-c18，柱温控制在50℃，流速为1ml/min，进样量为5微升。色谱柱的流动相：a为去离子水（含有1%甲酸）；b为乙腈（含有1%甲酸）。质谱条件：离子源为电喷雾离子源，采用正离子检测模式，扫描方式为多反应监测。样本前处理：取标准品混标、待测血样本50微升，加50微升蛋白沉淀剂，混匀后4℃、13200r/min离心（离心半径为7.4cm）4min。取上清10微升加50微升标记缓冲液混匀，瞬离。再加20微升衍生液混匀，瞬离后置55℃恒温衍生15min。将衍生后的样本置冰箱冷却后混匀瞬离，取50微升上机检测。

定量检测全谱氨基酸指标（50种）：丝胺酸、甘氨酸、组氨酸、苏氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天门冬氨酸、天门冬酰胺、丙氨酸、精氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、磷酸丝胺酸、磷酸乙醇胺、牛磺酸、羟基脯氨酸、乙醇胺、瓜氨酸、同型瓜氨酸、鸟氨酸、精氨基琥珀酸、肌氨酸、β-丙氨酸、肌肽、鹅肌肽、α氨基已二酸、γ氨基丁酸、3氨基异丁酸、2氨基异丁酸、2氨基正丁酸、5-羟基赖氨酸、5氨基戊酸、6氨基已酸、同型半胱氨酸、胱硫醚、5羟色胺、5羟色氨酸、犬尿氨酸、3甲基组氨酸、同型精氨酸、同型脯氨酸、同型丝氨酸。

3筛选可用于pcos精确诊断的氨基酸标记物

3.1确定pcos组中显著差异的氨基酸

筛选符合入组标准且各项指标齐全的pcos患者，最终入组108例。根据atpⅲ2005标准，pcos患者中满足以下5项指标中的3项及以上即可诊断其发生mets：①腰围>80cm；②甘油三酯(tg)1.7mmol/l(150mg/dl)，或已接受药物治疗；③高密度脂蛋白(hdl-c)<1.3mmol/l(50mg/dl)，或已接受药物治疗；④血压异常，收缩压130mmhg，或舒张压85mmhg；⑤空腹血糖(fpg)异常，fpg5.6mmol/l(100mg/dl)。pcos合并mets组（pcos-ms）共59例，未发生mets的低代谢风险pcos组（pcos-n）共49例，两组人群基本特征及临床检测指标标记如表1所示。两组间年龄以及一系列内分泌指标包括泌乳素、促卵泡刺激素、雌激素、黄体生成素lh、总睾酮、雄烯二酮、抗苗勒试管激素amh、孕酮均无显著差异，pcos合并mets组性激素结合球蛋白shbg明显降低、游离雄激素指数fai（fai=睾酮t×100/shbg）明显升高；代谢相关指标比较，两组间空腹血糖、空腹胰岛素水平、糖耐量、胰岛素耐量、甘油三酯、高密度胆固醇显著差异，符合代谢综合征表型特点；此外，pcos合并mets组中谷丙转氨酶、谷草转氨酶、γ-谷氨酰转肽酶、尿酸、c反应蛋白水平显著高于低代谢风险pcos组。

表1：pcos按照是否合并mets发生分组比较临床检测指标

注释：

临床指标英文及缩写：收缩压,sbp;舒张压,dbp;腰围,wc,waistcircumference;泌乳素,prolactin;雌激素,estradiol;总睾酮,totaltestosterone;雄烯二酮,androstenedione;性激素结合球蛋白,shbg,sexhormone-bindingglobulin;游离雄激素指数fai;孕酮,progesterone;空腹血糖,fpg,fastingplasmaglucose;空腹胰岛素,fsi,fastingseruminsulin;胰岛素抵抗指数,homa-ir,homeostasismodelassessmentofinsulinresistance;总胆固醇,tc,totalcholesterol;低密度脂蛋白,ldl-c,low-densitylipoproteincholesterol;高密度脂蛋白,hdl-c,high-densitylipoproteincholesterol;谷丙转氨酶,alt,alanineaminotransferase;谷草转氨酶,ast,aspartateaminotransferase;γ-谷氨酰转肽酶,γ-gt,γ-glutamyltranspeptidase;尿酸,uricacid;c反应蛋白,crp,c-reactiveprotein。

统计分析方法：采用spss20.0软件进行数据处理和分析。数据符合正态分布的用平均值±标准差表示，不符合正态分布的采用中位数和（25%-75%四分位区间差）表示，组间差异比较分别采用t检验或非参数检验（mann–whitneyu检验），p<0.05即表示两组之间有显著性差异，ns表示两组间没有显著差异。

利用质谱方法定量检测pcos患者血浆样本中全谱氨基酸水平，其中45种氨基酸在检测范围内。与低代谢风险pcos组比较，pcos合并mets组中丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、酪氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、氨基已二酸水平均显著升高；而天冬酰胺、甘氨酸、3氨基异丁酸水平显著降低（见表2）。

表2：pcos按照是否合并mets发生分组比较氨基酸水平（单位μmol/l）

注释：

氨基酸英文：丙氨酸,alanine;β-丙氨酸,β-alanline;缬氨酸,valine;异亮氨酸,isoleucine;亮氨酸,leucine;酪氨酸,tyrosine;苯丙氨酸,phenylalanine;色氨酸,tryptophan;5羟色氨酸,5-hydroxytryptophan;5羟色胺（褪黑素）,serotonin;犬尿氨酸,kynurenine;谷氨酸,glutamicacid;谷氨酰胺,glutamine;组氨酸,histidine;1甲基组氨酸methylhistidine;3甲基组氨酸,3-methylhistidine;天门冬氨酸,asparticacid;天门冬酰胺,asparagine;甘氨酸,glycine;精氨酸,arginine;羟基精氨酸,hydroxyarginine;脯氨酸,proline;同型脯氨酸,homoproline;羟基脯氨酸,hydroxyproline;赖氨酸,lysine;5-羟基赖氨酸,hydroxylysine;鸟氨酸,ornithine;瓜氨酸,citrulline;甲硫氨酸,methionine;半胱氨酸,cystine;同型半胱氨酸,homocysteine;苏氨酸,threonine;丝氨酸,serine;肌氨酸,sarcosine;牛磺酸,taurine;乙醇胺,ethanolamine;磷酸乙醇胺,phosphoethanolamine;α氨基已二酸,α-aminoadipicacid;γ-氨基丁酸,γ-aminobutyricacid;2氨基正丁酸,2-aminobutyricacid;3氨基异丁酸,3-aminoisobutyricacid;胱硫醚,cystathionine;鹅肌肽,anserine;精氨基琥珀酸,argininosuccinicacid。

统计分析方法同表1。

3.2建立基于氨基酸标记物的pcos发生mets的预测模型

我们选择表2中pcos合并mets组中差异显著且丰度相对较高的8种氨基酸（丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸），纳入logist回归，分析方法选择进入，基于这组氨基酸指标计算受试者发生mets的预测概率。logist回归分析模型系数的综合检验p<0.001，表示该模型总体有意义；hosmerandlemeshowtest（检验模型的拟合优度）p=0.429(>0.05)，表明当前数据中的信息已被充分提取，模型拟合优度较高。表3分析结果列出了纳入模型的氨基酸及其参数。

表3：基于8种氨基酸标记物的pcos患者发生mets的logisit回归分析

根据上述回归结果可以写出每个受试者根据这8种氨基酸水平预测pcos是否发生的危险得分logit(p):

logit(p)=-7.501+0.024*alaninelevel-0.020*valinelevel+0.045*leucinelevel-0.027*tyrosinelevel-0.057*asparaginelevel+0.012*glutamicacidlevel+0.082*cystinelevel-0.008*glycinelevel

并可以按照以下公式计算得到每一个受试者发生pcos的预测概率：

进一步利用受试者工作特征（roc）曲线下面积（auc）来判定这组氨基酸对pcos患者发生mets的预测能力，分析表明利用这组8种氨基酸建立的模型roc曲线下面积是0.892(0.830-0.953)，显著高于临床常用的mets诊断指标腰围、血压、空腹血糖、甘油三酯；另外，该模型灵敏度80.4%、准确性84.8%，相较其它临床指标可以较好地兼顾灵敏度和准确性（腰围灵敏度高、但准确性低；空腹血糖准确性高、但灵敏度低）（图1，表4）。

表4：roc曲线分析数据

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。