一种牛奶和奶粉中抗病毒药物残留检测方法与流程

本发明属于药物残留检测技术领域，具体涉及一种牛奶和奶粉中抗病毒药物残留检测方法。

背景技术：

为确保奶制品的食用安全，需对牛奶和奶粉中的抗病毒药物残留进行检测分析，通过检测以评估牛奶和奶粉各指标是否复合食品健康标准。当下的药物残留检测方法在对牛奶和奶粉中的抗病毒药物进行检测时，操作不便、灵敏度低、选择性和适用性不佳，不能很好的对牛奶和奶粉中抗病毒类药物残留的进行分离、识别以及快速检测。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种牛奶和奶粉中抗病毒药物残留检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种牛奶和奶粉中抗病毒药物残留检测方法，包括以下步骤：

s1提供待检测牛奶样品、待检测奶粉样品、牛奶空白样品、奶粉空白样品、酸化乙腈、无水硫酸镁、氯化钠；

s2均质提取所述待检测牛奶样品和待检测奶粉样品中的目标化合物；

s21对待检测牛奶样品中的目标化合物进行提取，得到混合液一；

s22对待检测奶粉样品中的目标化合物进行提取，得到混合液二；

s23提取混合液一、混合液二中的上清液，分别标记为提取液一、提取液二，备用；

s3分别对所述提取液一、提取液二进行净化处理，得到标准溶液一、标准溶液二；

s31移取2ml提取液一加至塑料离心管中，涡旋混匀1min，使用离心机离心处理3min后，吸取上清液过微孔滤膜，获得标准溶液一；

s32移取2ml提取液二加至塑料离心管中，涡旋混匀1min，使用离心机离心处理3min后，吸取上清液过微孔滤膜，获得标准溶液二；

s4对所述标准溶液一、标准溶液二进行梯度洗脱处理；

s5分别对洗脱处理后的标准溶液一和标准溶液二，进行超高效液相色谱-串联质谱仪检测处理，检测到5种抗病毒药物；

所述串联质谱仪的运行条件包括：

(1)所述串联质谱仪选用电喷雾离子源esi，离子源温度为550℃；电喷雾电压为5500v；

(2)所述串联质谱仪采用多反应监测mrm的检测方式；气帘气压力为35psi、碰撞气压力为9psi、雾化器压力为55psi、辅助气压力为60psi；

(3)所述串联质谱仪采用正离子模式进行扫描；入口电压为10.0v、碰撞室出口电压为6v；

5种抗病毒药物分别为金刚烷胺、咪喹莫特、奥司他韦、美金刚和金刚乙胺；

s6对所述5种抗病毒药物的标准曲线、相关系数、检测限和定量限进行检测计算；

s61在牛奶空白样品中添加一系列质量浓度的提取液一，以提取液一的质量浓度为横坐标，以质谱定量峰面积为纵坐标绘制标准曲线；

s62在奶粉空白样品中添加一系列质量浓度的提取液二，以提取液二的质量浓度为横坐标，以质谱定量峰面积为纵坐标绘制标准曲线；

s63以信噪比s/n＝3确定检测限，以信噪比s/n＝10确定定量限，根据标准曲线分别计算5种抗病毒药物的相关系数、检测限和定量限；

s7对所述5种抗病毒药物的加标回收率及相对标准偏差rsd进行计算：

s71按低、中高、高三种添加水平将标准溶液一加入牛奶样品中，每种添加水平平行测定6次，计算5种抗病毒药物的平均加标回收率和相对标准偏差；

s72按低、中高、高三种添加水平将标准溶液二加入奶粉样品中，每种添加水平平行测定6次，计算5种抗病毒药物的平均加标回收率和相对标准偏差。

作为一种优选的实施方式，取10ml醋酸加至乙腈中，并定容至1l得到所述酸化乙腈。

作为一种优选的实施方式，称取10g牛奶样品置于50ml的离心管中，依次加入20ml酸化乙腈、5g无水硫酸镁和2g氯化钠，震荡处理1min后，使用离心机离心处理3min，得到混合液一；

和/或，称取2g奶粉样品置于50ml离心管中，加10ml水进行涡旋混匀，静置30min，依次加入20ml酸化乙腈、5g无水硫酸镁和2g氯化钠，震荡处理1min后，使用离心机离心处理3min，得到混合液二。

作为一种优选的实施方式，所述离心机的工作参数为5000r/min；加入无水硫酸镁和氯化钠时，随着溶液中盐浓度增大，蛋白质沉淀析出进行脱水盐析处理。

作为一种优选的实施方式，所述净化处理采用quechers技术；所述塑料离心管中含有200mg无水硫酸镁、50mgpsa和50mgc18；通过无水硫酸镁、psa、c18吸附杂质以进行除杂净化。

作为一种优选的实施方式，所述梯度洗脱处理条件包括：

(1)梯度洗脱的流动相采用0.1％甲酸水作为a相、乙腈作为b相；

(2)梯度洗脱的流速为0.3ml/min。

作为一种优选的实施方式，所述超高效液相色谱的运行条件包括：

(1)所述超高效液相色谱选用acquityuplcbehc18色谱柱；c18色谱柱的规格为2.1mm×150mm，1.7μm、c18色谱柱的柱温为40℃；

(2)所述超高效液相色谱的进样量为2μl。

作为一种优选的实施方式，c18色谱柱的填料孔径为1.7μm；c18色谱柱的内径为2.1mm，柱长为150mm。

作为一种优选的实施方式，采用正离子模式进行扫描，结合多反应监测mrm模式进行检测，所述洗脱处理后的标准溶液一和标准溶液二经高效液相色谱-串联质谱仪检测处理，溶液中的5种目标化合物在所述c18色谱柱上分离，即得到5种抗病毒药物和金刚烷胺同位素的离子色谱图。

作为一种优选的实施方式，牛奶样品中，所述三种添加水平分别为5μg/kg、10μg/kg和50μg/kg；奶粉样品中，所述三种添加水平分别为25μg/kg、50μg/kg和250μg/kg。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、该牛奶和奶粉中抗病毒药物残留检测方法，建立了一个测定牛奶和奶粉中金刚烷胺、咪喹莫特、奥司他韦、美金刚、金刚乙胺这五种抗病毒类药物的残留体系，实现五种抗病毒类药物的分离、识别和检测；

2、该牛奶和奶粉中抗病毒药物残留检测方法，通过在满足超高效液相色谱条件、梯度洗脱条件和串联质谱条件这三个条件下进行检测，根据所得到色谱图中峰高的不同，提供目标化合物的定性定量分析依据，从而识别得到5种抗病毒药物；

3、该牛奶和奶粉中抗病毒药物残留检测方法，通过计算平均回收率和相对标准偏差，得出加标平均回收率接近100％，相对偏差小，说明本发明提出的检测方法选择性和适用性好，可实现于牛奶和奶粉这两种基质中，对金刚烷胺、咪喹莫特、奥司他韦、美金刚和金刚乙胺这五种化合物残留的快速检测；

综上，本发明提出的抗病毒药物残留检测方法，操作简单、灵敏度高、选择性好，适用于牛奶和奶粉中抗病毒类药物残留的快速检测。

附图说明

图1为本发明牛奶和奶粉中抗病毒药物残留检测方法的流程图；

图2为本发明金刚烷胺-d15的离子色谱图；

图3为本发明金刚烷胺的离子色谱图；

图4为本发明咪喹莫特的离子色谱图；

图5为本发明奥司他韦的离子色谱图；

图6为本发明美金刚的离子色谱图；

图7为本发明金刚乙胺的离子色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的描述。

以下实施例用于说明本发明，但不能用来限制本发明的保护范围。实施例中的条件可以根据具体条件做进一步的调整，在本发明的构思前提下对本发明的方法简单改进都属于本发明要求保护的范围。

请参阅图1，一种牛奶和奶粉中抗病毒药物残留检测方法，包括以下步骤：

s1提供待检测牛奶样品、待检测奶粉样品、牛奶空白样品、奶粉空白样品、酸化乙腈、无水硫酸镁、氯化钠；

取10ml醋酸加至乙腈中，并定容至1l得到所述酸化乙腈。

s2均质提取所述待检测牛奶样品和待检测奶粉样品中的目标化合物；

s21对待检测牛奶样品中的目标化合物进行提取，得到混合液一；

称取10g牛奶样品置于50ml的离心管中，依次加入20ml酸化乙腈、5g无水硫酸镁和2g氯化钠，震荡处理1min后，使用离心机离心处理3min，得到混合液一。

s22对待检测奶粉样品中的目标化合物进行提取，得到混合液二；

称取2g奶粉样品置于50ml离心管中，加10ml水进行涡旋混匀，静置30min，依次加入20ml酸化乙腈、5g无水硫酸镁和2g氯化钠，震荡处理1min后，使用离心机离心处理3min，得到混合液二。

所述离心机的工作参数为5000r/min；加入无水硫酸镁和氯化钠时，随着溶液中盐浓度增大，蛋白质沉淀析出进行脱水盐析处理。

s23提取混合液一、混合液二中的上清液，分别标记为提取液一、提取液二，备用；

s3分别对所述提取液一、提取液二进行净化处理，得到标准溶液一、标准溶液二；

s31移取2ml提取液一加至塑料离心管中，涡旋混匀1min，使用离心机离心处理3min后，吸取上清液过微孔滤膜，获得标准溶液一；

s32移取2ml提取液二加至塑料离心管中，涡旋混匀1min，使用离心机离心处理3min后，吸取上清液过微孔滤膜，获得标准溶液二；

所述净化处理采用quechers技术；所述塑料离心管中含有200mg无水硫酸镁、50mgpsa和50mgc18；通过无水硫酸镁、psa、c18吸附杂质以进行除杂净化。

s4对所述标准溶液一、标准溶液二进行梯度洗脱处理；

所述梯度洗脱处理条件包括：

(1)梯度洗脱的流动相采用0.1％甲酸水作为a相、乙腈作为b相；

(2)梯度洗脱的流速为0.3ml/min。

流动相梯度洗脱条件，如表1所示：

表1：

通过梯度洗脱以提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和提高分离精度。

s5分别对洗脱处理后的标准溶液一和标准溶液二，进行超高效液相色谱-串联质谱仪检测处理，检测到5种抗病毒药物；

所述超高效液相色谱的运行条件包括：

(1)所述超高效液相色谱选用acquityuplcbehc18色谱柱；c18色谱柱的规格为2.1mm×150mm，1.7μm、c18色谱柱的柱温为40℃；

c18色谱柱的填料孔径为1.7μm；c18色谱柱的内径为2.1mm，柱长为150mm。

(2)所述超高效液相色谱的进样量为2μl。

所述串联质谱仪的运行条件包括：

(1)所述串联质谱仪选用电喷雾离子源esi，离子源温度为550℃；电喷雾电压为5500v。

(2)所述串联质谱仪采用多反应监测mrm的检测方式；气帘气压力为35psi、碰撞气压力为9psi、雾化器压力为55psi、辅助气压力为60psi。

(3)所述串联质谱仪采用正离子模式进行扫描；入口电压为10.0v、碰撞室出口电压为6v。

采用正离子模式进行扫描，结合多反应监测mrm模式进行检测，所述洗脱处理后的标准溶液一和标准溶液二经高效液相色谱-串联质谱仪检测处理，溶液中的5种目标化合物在所述c18色谱柱上分离，即得到5种抗病毒药物和金刚烷胺同位素的离子色谱图。5种抗病毒药物分别为金刚烷胺、咪喹莫特、奥司他韦、美金刚和金刚乙胺。

请再结合参阅图2-7，图2所示为金刚烷胺-d15的离子色谱图；图3所示为金刚烷胺的离子色谱图；图4所示为咪喹莫特的离子色谱图；图5所示为奥司他韦的离子色谱图；图6所示为美金刚的离子色谱图；图7所示为金刚乙胺的离子色谱图。上述色谱图为在满足超高效液相色谱条件、梯度洗脱条件和串联质谱条件这三个条件下进行检测处理得到，根据色谱图中峰高的不同，提供目标化合物的定性分析依据，从而识别得到5种抗病毒药物。

使用外标法进行定量，高效液相色谱-串联质谱仪检测的检测结果如表2所示：

表2：

参照表2，可以得出，在表中检测仪器参数条件下，可很好的分离、识别和检测出5种抗病毒药物。

s6对所述5种抗病毒药物的标准曲线、相关系数、检测限和定量限进行检测计算；

s61在牛奶空白样品中添加一系列质量浓度的提取液一，以提取液一的质量浓度为横坐标，以质谱定量峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

s62在奶粉空白样品中添加一系列质量浓度的提取液二，以提取液二的质量浓度为横坐标，以质谱定量峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

s63以信噪比s/n＝3确定检测限，以信噪比s/n＝10确定定量限，根据标准曲线分别计算5种抗病毒药物的相关系数、检测限和定量限。

所述5种抗病毒药物的标准曲线、相关系数、检测限和定量限的检测计算结果如表3所示。

表3：

参照表3，可以得出，5种抗病毒药物在1～100μg/l范围内呈现出良好的线性关系，相关系数r均大于0.995。以信噪比s/n＝3确定检出限，以s/n＝10确定定量限，得出，5种抗病毒药物在牛奶中的检测限为0.03μg/kg，定量限为0.1μg/kg。5种抗病毒药物在奶粉中的检测限为0.15μg/kg，定量限为0.5μg/kg。

s7对所述5种抗病毒药物的加标回收率及相对标准偏差rsd进行计算：

s71按低、中高、高三种添加水平将标准溶液一加入牛奶样品中，每种添加水平平行测定6次，计算5种抗病毒药物的平均加标回收率和相对标准偏差；

牛奶样品中，所述三种添加水平分别为5μg/kg、10μg/kg和50μg/kg。

s72按低、中高、高三种添加水平将标准溶液二加入奶粉样品中，每种添加水平平行测定6次，计算5种抗病毒药物的平均加标回收率和相对标准偏差；

奶粉样品中，所述三种添加水平分别为25μg/kg、50μg/kg和250μg/kg。

所述5种抗病毒药物的加标回收率及相对标准偏差rsd的计算结果如表4所示。

表4：

参照表4，可以得出，5种抗病毒药物在牛奶基质中三个添加水平(5、10和50μg/kg)下的加标回收率为87.2％～105.8％，相对标准偏差(rsd，n＝6)为2.1％～6.2％。5种抗病毒药物在在奶粉基质中三个添加水平(25、50和250μg/kg)下的加标回收率为86.4％～104.9％，相对标准偏差(rsd，n＝6)为2.4％～6.4％。通过计算平均加标回收率和相对标准偏差rsd，得出评价回收率接近100％，相对偏差小，说明本发明提出的检测方法选择性适用性好，可用于牛奶和奶粉这两种基质中，对金刚烷胺、咪喹莫特、奥司他韦、美金刚、金刚乙胺这五种化合物残留的检测。

综上所述，相较于当下的药物残留检测方法，本实施例提出的药物残留检测方法具有下述优点：

本实施例建立了一个测定牛奶和奶粉中金刚烷胺、咪喹莫特、奥司他韦、美金刚、金刚乙胺这五种抗病毒类药物的残留体系，实现五种抗病毒类药物的分离、识别和检测。通过在满足超高效液相色谱条件、梯度洗脱条件和串联质谱条件这三个条件下进行检测，根据所得到色谱图中峰高的不同，提供目标化合物的定性定量分析依据，从而识别得到5种抗病毒药物。通过计算平均回收率和相对标准偏差，得出加标平均回收率接近100％，相对偏差小，说明本实施例提出的检测方法选择性和适用性好，可实现于牛奶和奶粉这两种基质中，对金刚烷胺、咪喹莫特、奥司他韦、美金刚和金刚乙胺这五种化合物残留的快速检测。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。