一种基于液质联用的α-淀粉酶抑制剂的评估方法

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种基于液质联用的α-淀粉酶抑制剂的评估方法及应用。

背景技术：

餐后血糖的管理是糖尿病治疗和预防的重要方面。其中，抑制人体肠道中的α-淀粉酶活性进而降低由食物中淀粉向葡萄糖的转化，已经是治疗糖尿病的一种临床常用方法。因此如何高效、快速、精准的开发对于α-淀粉酶具有抑制活性的抑制剂，也一直是相关领域的研究热点。目前几乎所有的α-淀粉酶抑制剂开发都依赖于对酶活性的测定。一般来说，通过测定体外酶活反应体系最终的酶促反应的产物的量，进而反应酶的活力水平；并通过添加抑制剂，与对照组进行比较，评估抑制剂的抑制效果。目前常用的体外酶活测定方法方法有两大类，分别是还原糖测定法和人造底物法。

还原糖测定法是直接使用淀粉作为酶促反应的底物，酶促反应之后，通过各种显色的方法，如dns或gopod法测定产物中还原糖的量，间接的反应酶活力水平。人造底物法是使用人工合成的改性淀粉，在淀粉链上连接荧光或者具有紫外吸收的基团，在酶水解这类底物的时候，通过检测到荧光或具有紫外吸收的基团从淀粉链中释放速率，进而反应没活力水平。但是这两类方法均存在一个弊端，既α-淀粉酶对于淀粉的水解，会产生包括聚合度在2至10不等的麦芽糖多聚物，这两大类方法都无法测定每一种产物具体的量，因此不能准确反映酶消化淀粉的真实过程，最终测得的仅仅是酶消化淀粉的一个表观形象。其次，还原糖法还有一个致命缺陷，就是当测试的酶的抑制剂具有还原性时，往往会导致测试结果的强烈干扰，以至于无法准确评价抑制剂的效果。人造底物法存在的重大缺陷是，其使用的是人工合成的底物，并不能准确、真实的反应酶催化淀粉水解的过程，而是一种近似的模拟。

因此，现有技术中目前仍需要探索新的适于α-淀粉酶检测的方法，有鉴于此，提出本发明。

技术实现要素：

本发明的目的是寻求一种客观、准确的适于α-淀粉酶检测的方法基于液质联用的α-淀粉酶抑制剂的评估方法。为实现上述目的，本发明使用液质联用技术，使用天然淀粉作为酶促反应底物，直接从酶促反应体系中将所有聚合度的反应产物进行分离，然后通过质谱直接对各个产物进行定量。从而真实、客观、详尽的反应α-淀粉酶催化淀粉水解的过程。相较于传统方法仅能通过测定酶促反应产物还原性末端的总量或释放的荧光基团和紫外发色基团的总量而间接反映酶活的根本原理不同的是，本发明可以直接准确定量所有酶促反应产物的量，相较于传统方法在精细度上达到新的高度。同时，本发明还可以避免人造底物作为测定酶活反应所导致的失真；并且，由于前端色谱技术的加持，又可以避免在评价还原性抑制剂时产生的干扰。

本发明首先提供一种基于液质联用的α-淀粉酶抑制剂的评估方法，包括如下步骤：

步骤1)样品处理：取经α-淀粉酶催化反应后样本，用甲醇、乙醇或者乙腈进行稀释，过滤后制备上样样本；

步骤2)液相分离：使用基于亲水作用的色谱柱进行分离，其中流动相为有机相和水相，所述有机相为乙腈、甲醇或乙醇，所述水相为甲酸铵或乙酸铵溶液；

步骤3)质谱检测：利用低分辨或高分辨质谱进行检测；

步骤4)数据处理：对数据进行绝对定量和/或相对定量处理。

进一步的，所述步骤1)中，采用与样本等体积的甲醇、乙醇或者乙腈进行稀释；所述过滤采用滤膜过滤，所述滤膜采用0.1-0.45μm的滤膜过滤；优选的采用0.22μm滤膜过滤；

进一步的，所述步骤2)中色谱柱包括但不限于capcellcorepc色谱柱或accucore150-amide-hilic色谱柱；

在一些实施方式中，所述色谱柱包括但不限于capcellcorepc色谱柱(2.1×50mm，2.7μm)或accucore150-amide-hilic色谱柱(2.1×50mm，2.6μm)；所述色谱柱的柱温设置40℃。

进一步的，所述步骤2)中水相中甲酸铵浓度为1-5mm，优选的为1mm；所述水相中乙酸铵浓度1-5mm，优选的为5mm。

进一步的，所述步骤2)中水相比例为10-50％，优选的为25-40％，更优选的为30-37％；所述流动相的流速0.3-1ml/min,优选的为0.3ml/min。

进一步的，所述步骤3)中检测为检测样本中麦芽糖(g2)、麦芽三糖(g3)、麦芽四糖(g4)、麦芽五糖(g5)、麦芽六糖(g6)、麦芽七糖(g7)、麦芽八糖(g8)麦芽九糖(g9)和麦芽十糖(g10)中至少三个、四个、五个、六个、七个、八个或全部。

进一步的，所述步骤3)中所述质谱离子源为电喷雾离子源(esi)，包括但不限于jetstreamtechnologyesi或hesi；优选的，所述质谱的源电压设置在3.5-5.5kv之间，源温度设置在350-550℃之间，鞘气设置在30-50ml/min之间，辅助气设置为10ml/min。

进一步的，所述步骤4)中所述绝对定量使用麦芽糖(g2)、麦芽三糖(g3)、麦芽四糖(g4)、麦芽五糖(g5)、麦芽六糖(g6)、麦芽七糖(g7)、麦芽八糖(g8)麦芽九糖(g9)和麦芽十糖(g10)中至少三个、四个、五个、六个、七个、八个或全部。做外标曲线，所有检测产物使用峰面积与浓度进行拟合，优选的为线性拟合；所述相对定量用测试组的产物峰面积与对照组做比值计算。

本发明还提供一种基于液质联用的α-淀粉酶抑制剂的评估中的应用。

进一步的，所述应用通过检测α淀粉酶酶促产物量来检测α淀粉酶的活性，所述产物包括麦芽糖(g2)、麦芽三糖(g3)、麦芽四糖(g4)、麦芽五糖(g5)、麦芽六糖(g6)、麦芽七糖(g7)、麦芽八糖(g8)麦芽九糖(g9)和麦芽十糖(g10)中至少三个、四个、五个、六个、七个、八个或全部。

更进一步的，通过上述具体方法进行评估。

本发明还提供一种用于液质联用试剂在制备α-淀粉酶抑制剂评估的检测试剂中的应用。

本发明还提供一种α-淀粉酶抑制剂评估的检测试剂，其特征在于，所述试剂包括液相色谱分离试剂和质谱检测试剂，

所述液相色谱分离试剂中包括乙腈、甲醇或乙醇的有机相，和甲酸铵或乙酸铵溶液的水相；

所述质谱检测试剂能够用于麦芽糖(g2)、麦芽三糖(g3)、麦芽四糖(g4)、麦芽五糖(g5)、麦芽六糖(g6)、麦芽七糖(g7)、麦芽八糖(g8)麦芽九糖(g9)和麦芽十糖(g10)中至少三个、四个、五个、六个、七个、八个或全部。的检测。

与现有技术相比，本发明至少具有如下优势：

1)本发明提供一种全新的α-淀粉酶抑制剂的评估方法，该方法可以更加准确的反映α-淀粉酶催化淀粉水解的真实过程，从而可以对于酶抑制剂的开发提供更可靠的依据。传统的方法普遍只能反应酶促反应以及酶的抑制剂作用的宏观情况，而无法确定抑制剂对于酶的每一种产物的抑制作用。因此在用这些方法开发抑制剂的时候，无法确定抑制剂究竟降低了哪种产物的量。本发明可以直接测定每一种酶促反应产物的量，进而精细的勾勒酶促反应过程。用本方法用于α-淀粉酶抑制剂开发的时候，可以更好地判断抑制剂对于具体酶促反应产物的抑制作用。

2)本发明可以避免在开发具有还原性以及荧光的抑制剂对于传统测定方法的干扰。传统的的α-淀粉酶测定方法普遍依赖于光度的测量，但是某些抑制剂会产生光度的干扰，进而导致了在评价这类抑制剂活性的时候，无法准确的定量其活性。本方法在前端引入了色谱的方法，在分离各种酶促反应产物的同时，也将会产生干扰的抑制剂从体系中去除。从而比能比传统方法更准确的表征这类抑制剂的作用。

3)本发明通过实验证实了麦芽糖(g2)、麦芽三糖(g3)、麦芽四糖(g4)、麦芽五糖(g5)、麦芽六糖(g6)、麦芽七糖(g7)、麦芽八糖(g8)麦芽九糖(g9)和麦芽十糖(g10)可作为基于液质联用的α-淀粉酶抑制剂评估的有效指标。

4)本发明确立一套具体的适用于α-淀粉酶抑制剂的评估方法体系，其无需购买昂贵的荧光/紫外改性底物，可直接使用一般或天然的淀粉溶液。因此具有高效、准确、真实、客观等诸多优势，克服现有技术不足，适于产业推广使用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1人唾液α-淀粉酶酶促反应的产物全扫描分析结果；

图2不同浓度的流动相的信号比较图；

图3不同比例流动相的信号比较图；

图4不同源电压对酶促反应产物信号图；

图5猪胰腺α-淀粉酶酶促反应的产物全扫描分析结果图；

图6不同反应时间下猪胰腺α-淀粉酶酶促反应产物检测结果图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下术语或定义仅仅是为了帮助理解本发明而提供。这些定义不应被理解为具有小于本领域技术人员所理解的范围。

除非在下文中另有定义，本发明具体实施方式中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本发明。

如本发明中所使用，术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”为包含性的(inclusive)或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。术语“由…组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中某一组被定义为包含至少一定数目的实施方案，这也应被理解为揭示了一个优选地仅由这些实施方案组成的组。

在提及单数形式名词时使用的不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”，“所述”，包括该名词的复数形式。

本发明中的术语“大约”、“大体”表示本领域技术人员能够理解的仍可保证论及特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示偏离指示数值的±10％，优选±5％。

此外，说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)以及诸如此类，是用于区分相似的元素，不是描述顺序或时间次序必须的。应理解，如此应用的术语在适当的环境下可互换，并且本发明描述的实施方案能以不同于本发明描述或举例说明的其它顺序实施。

本发明所述的基于液质联用的α-淀粉酶抑制剂的评估方法，总体思路包括如下步骤：

1)样品处理步骤：经过α-淀粉酶催化反应后的混合物，用一定体积(比如等体积)的甲醇、乙醇或者乙腈稀释，滤膜过滤后用于检测分析。具体上样量依据色谱柱和具体分析的需要，诸如上样体积在0.1到10μl之间。

2)液相分离步骤：使用基于亲水作用的色谱柱，流动相分为有机相和水相两类，其中有机相优选的为乙腈、甲醇或乙醇；水相优选的为一定浓度的甲酸铵或乙酸铵溶液。流动相中水相的比例根据最终需要的分离度、所选用的色谱柱种类。

3)质谱检测步骤：低分辨或高分辨质谱都适用于本发明的检测。但通常来说，使用低分辨质谱的分析时间相较于高分辨质谱要适当延长，以避免酶促反应体系中的杂质对于小分子量产物的影响。比如，所述质谱的离子源可为电喷雾离子源(esi)，包括但不限于jetstreamtechnologyesi、hesi等基于esi源的一般改进型。

4)数据处理步骤：本发明的数据处理大体上可分为绝对定量处理和相对定量处理，其中，绝对定量使用葡萄糖(g)、麦芽糖(g2)、麦芽三糖(g3)、麦芽四糖(g4)、麦芽五糖(g5)，麦芽六糖(g6)、麦芽七糖(g7)、麦芽八糖(g8)麦芽九糖(g9)和麦芽十糖(g10)等α淀粉酶中的酶促产物标准品的之一或多个或全做做外标曲线，所有产物均使用峰面积与浓度进行线性拟合。相对定量用测试组的产物峰面积与对照组做比值。

可以理解本发明的方法可应用于抑制剂开发以及其他方面单纯酶活检测，因此并不属于疾病的诊断方法范畴。

下面为具体的实施方法。

实施例1人唾液α-淀粉酶酶促反应的产物分析

1)样品准备：称取一定质量的人唾液淀粉酶冻干粉，使用50mm的磷酸盐缓冲液溶解，稀释成0.5u/ml酶溶液，然后加入5倍体积的质量浓度0.5％的淀粉溶胶，置于37℃下温育1h，然后加入等体积的冰甲醇(＜4℃)。随后样品使用0.22μm滤膜过滤，然后置于4℃下，用于分析酶促反应的产物。

2)液相条件：capcellcorepc色谱柱(2.1×50mm，2.7μm)，柱温30℃。流速0.3ml/min。流动相a为乙腈，b为50mm的甲酸铵溶液。b相比例为35％，等度洗脱。进样量1μl。

3)质谱条件：安捷伦6470b三重四极杆质谱，装配jetstreamtechnologyesi离子源，离子传输管温度300℃，辅助气温度300摄氏度，流速5l/min，鞘气温度250摄氏度，流速11l/min。正离子模式监测，喷雾电压5.0kv，分别使用全扫描模式和多反应监测模式，其中多反应监测模式根据所检测的产物，碰撞能量优选的在0-50v之间。

结果：参加图1，全扫描模式共检测到五个产物，与标准品保留时间和准分子离子峰比对，分别是葡萄糖(g1)、麦芽糖(g2)、麦芽三糖(g3)、麦芽四糖(g4)、麦芽五糖(g5)。除葡萄糖外使用前体离子检测外，其他产物用mrm模式测定，这四个产物用于定量的离子对分别为：麦芽糖，365.0，202.7，麦芽三糖，527.1，365.0，麦芽四糖，688.6，527.0，麦芽五糖，852.0，688.6。

实施例2流动相浓度对α-淀粉酶检测影响

1)样品准备：称取一定质量的体外重组α-淀粉酶冻干粉，使用50mm的磷酸盐缓冲液溶解，稀释成0.5u/ml酶溶液，然后加入5倍体积的质量浓度0.5％的淀粉溶胶，置于37℃下温育1h，95℃加热5min，然后加入等体积的乙腈，样品使用0.22μm滤膜过滤，用于分析酶促反应产物。

2)液相条件：accucore150-amide-hilic色谱柱(2.1×50mm，2.6μm)，柱温40℃。流动相a为乙腈，b为不同浓度的的甲酸铵或不同浓度乙酸铵的溶液。用于分析不同浓度甲酸铵和乙酸铵对于酶促反应产物检测的影响。流速0.3ml/min,b相比例为20％。进样量3μl。

3)质谱条件：赛默飞世尔qexactiveorbitrap高分辨质谱，装配hesi离子源，离子传输管温度400℃，辅助气温度300摄氏度，流量10arb，鞘气：45arb；喷雾电压3.5kv，使用全扫描模式检测酶促反应产物。

4)不同浓度的流动相测得主要酶促产物信号强度进行归一化处理，比较不同浓度的甲酸铵和乙酸铵的信号响应。

结果：全扫描模式共检测到五个产物，与标准品保留时间和准分子离子峰比对，分别是葡萄糖(g1)、麦芽糖(g2)、麦芽三糖(g3)、麦芽四糖(g4)、麦芽五糖(g5)。对于甲酸铵来说，1-5mm的流动相是优选的，最优选的为1mm(图2左)，对于乙酸铵来说1-5mm的流动相是优选，其中最优选的为5mm(图2右)。

实施例3流动相比例对α-淀粉酶检测影响

1)样品准备：称取一定质量的体外重组α-淀粉酶冻干粉，使用50mm的磷酸盐缓冲液溶解，稀释成0.5u/ml酶溶液，然后加入5倍体积的质量浓度0.5％的淀粉溶胶，置于37℃下温育1h，95℃加热5min，然后加入等体积的乙腈，样品使用0.22μm滤膜过滤，用于分析酶促反应产物。

2)液相条件：accucore150-amide-hilic色谱柱(2.1×50mm，2.6μm)，柱温40℃。流动相a为乙腈，b为1mm的甲酸铵。流速0.3ml/min,b相比例依次取20％，25％，30％，35％。进样量3μl。

3)质谱条件：赛默飞世尔qexactiveorbitrap高分辨质谱，装配hesi离子源，离子传输管温度400℃，辅助气温度300摄氏度，流量10arb，鞘气：45arb；喷雾电压3.5kv，使用全扫描模式检测酶促反应产物。

结果：不同比例的流动相结果如图3所示，可见更大比例的甲酸铵(极性相)有助于洗脱，但是会降低分离度。因此优选25-40％比例的甲酸铵极性相用于α-淀粉酶的检测。

实施例4质谱离子源电压α-淀粉酶主要产物信号强度的影响

1)样品准备：称取一定质量的体外重组α-淀粉酶冻干粉，使用50mm的磷酸盐缓冲液溶解，稀释成0.2u/ml酶溶液，然后加入3倍体积的质量浓度0.5％的淀粉溶胶，置于37℃下温育30min，95℃加热5min，然后加入等体积的乙腈，样品使用0.22μm滤膜过滤，用于分析酶促反应产物。

2)液相条件：accucore150-amide-hilic色谱柱(2.1×50mm，2.6μm)，柱温40℃。流动相a为乙腈，b为1mm的甲酸铵。流速0.3ml/min,b相比例为35％。进样量3μl。

3)质谱条件：赛默飞世尔qexactiveorbitrap高分辨质谱，装配hesi离子源，离子传输管温度400℃，辅助气温度300摄氏度，流量10arb，鞘气：45arb；喷雾电压依次取3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0kv，使用全扫描模式检测酶促反应产物。

4)数据处理：不同源电压下测得主要酶促产物信号强度进行归一化处理。

结果：不同源电压下主要的酶促反应产物信号如图4所示。可以看出，在4.5-6.0kv为优选的源电压区间，该区间下更适于α-淀粉酶的检测。

实施例5定量测定猪胰腺α-淀粉酶的活性

1)样品准备：称取一定质量的猪胰腺冻干粉，使用50mm的磷酸盐缓冲液溶解，离心取上清液稀释100倍，加入4倍体积的质量浓度0.2％的淀粉溶胶，置于37℃下温育，随时间递增连续取样，取出的反应物加入两倍体积的冰乙腈(＜-40℃)。随后样品使用0.22μm滤膜过滤，置于4℃，用于分析酶促反应的产物。

2)液相条件：accucore150-amide-hilic色谱柱(2.1×50mm，2.6μm)，柱温40℃。流动相a为乙腈，b为5mm的甲酸铵溶液。b相比例为37％，等度洗脱。流速变化如下，0-3min，0.3-0.4ml/min，3-4.5min，0.4-0.5ml/min，4.5-4.6min，0.5-0.3ml/min，4.6-5.0min，0.3ml/min。进样量1μl。

3)质谱条件：赛默飞世尔qexactiveorbitrap高分辨质谱，装配hesi离子源，离子传输管温度400℃，辅助气温度300摄氏度，流量10arb，鞘气：45arb；喷雾电压5.0kv，使用单离子扫描模式测定产物，监测的离子质荷比如下：203.05，356.10，527.15，689.21，851.26，1013.31，1175.37，1337.42，监测窗口宽度为3m/z。

4)标曲绘制：用50％的甲醇分别配置物质的量浓度在2um至100um之间的葡萄糖(g1)，麦芽糖(g2)，麦芽三糖(g3)、麦芽四糖(g4)、麦芽五糖(g5)，麦芽六糖(g6)、麦芽七糖(g7)、麦芽八糖(g8)麦芽九糖(g9)和麦芽十糖(g10)的标准溶液，使用和样品同样的分析条件，绘制外标定量标准曲线。

结果：除质荷比为203.05的离子外(对应g1)，其他九个离子分别被测到，按质荷比顺序分别为麦芽糖(g2)，麦芽三糖(g3)、麦芽四糖(g4)、麦芽五糖(g5)，麦芽六糖(g6)、麦芽七糖(g7)、麦芽八糖(g8)麦芽九糖(g9)和麦芽十糖(g10)(图5)，九种产物随酶促反应的时间增加，而逐渐增加(图6)。

可见，在α-淀粉酶淀粉酶消化淀粉的过程中，总共产生了9种可以被定量的产物，分别是g2-g10，除了g9在反应超过50分钟时产量会降低，g10在反应超过30分钟后产量会降低之外，所有的产物都在酶促反应的过程中逐渐增加，但是其增加的速率各不相同。随着反应时间的延长，每种产物的比例会有所变化。

实施例6测定阿卡波糖和两种多酚对猪胰腺α-淀粉酶的抑制作用

1)样品准备：使用50mm的磷酸盐缓冲液溶解配置0.2u/ml的猪胰腺淀粉酶溶液，分别与等体积、定浓度的阿卡波糖、多酚a和多酚b溶液(抑制剂组)，以及不添加任何化合物的溶剂(对照组)混合，在25℃下孵育5min，然后加入3倍体积的0.2％的淀粉溶胶，置于37℃下温育。20mi后，向反应物中加入两倍体积的冰乙腈(＜-40℃)。随后样品使用0.22μm滤膜过滤，置于4℃，用于分析酶促反应的产物。

2)液相条件：accucore150-amide-hilic色谱柱(2.1×50mm，2.6μm)，柱温40℃。流动相a为乙腈，b为5mm的甲酸铵溶液。b相比例为37％，等度洗脱。流速变化如下，0-3min，0.3-0.4ml/min，3-4.5min，0.4-0.5ml/min，4.5-4.6min，0.5-0.3ml/min，4.6-5.0min，0.3ml/min。进样量1μl。

3)质谱条件：赛默飞世尔qexactiveorbitrap高分辨质谱，装配hesi离子源，离子传输管温度400℃，辅助气温度300摄氏度，流量10arb，鞘气：45arb；喷雾电压5.0kv，使用单离子扫描模式测定产物，监测的离子质荷比如下：356.10，527.15，689.21，851.26，1013.31，1175.37，1337.42，1499.48，1661.53，监测窗口宽度为0.4m/z。

4)数据处理：用对照组测得的每种酶促反应产物的量减去抑制剂组每种酶促反应产物的量，并处以对照组产物的量，用于评价抑制剂对于每种产物的抑制作用。

结果，总共有9种酶促反应产物被相对比较，分别是麦芽糖(g2)，麦芽三糖(g3)、麦芽四糖(g4)、麦芽五糖(g5)，麦芽六糖(g6)、麦芽七糖(g7)、麦芽八糖(g8)，麦芽九糖(g9)和麦芽十糖(g10)。阿卡波糖以及多酚a和多酚b对于这九种酶促反应产物的抑制率如下表所示(表1)，其中，所有的抑制剂浓度均为100μm。

表1阿卡波糖以及多酚a和多酚b对于这九种酶促反应产物的抑制率

结论：基于本发明的方法体系能够有效用于α-淀粉酶的检测，进而可应用于测定阿卡波糖和两种多酚对猪胰腺α-淀粉酶的抑制作用。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。