胃泌素17胶乳增强比浊法测定试剂盒及其制备使用方法与流程

1.本发明涉及免疫学测定领域，尤其涉及一种胃泌素17胶乳增强比浊法测定试剂盒及其制备使用方法。


背景技术：

2.胃泌素是一种重要的胃肠道肽类激素，于1905年由英国学者edkins首先发现并命名。胃泌素由位于胃窦及十二指肠近端黏膜的g细胞合成及分泌，成熟胃泌素是酰胺化的胃泌素，酰胺化胃泌素包括g17、g34、g14、g6、g52、g71，其中g17是胃窦中胃泌素的主要形式，为进餐后血液中胃泌素的主要形式。
3.胃癌患者血清g17的水平与病变部位、临床分期、病理组织分型相关。由于癌组织大量破坏泌酸腺体和迷走神经末梢，使胃酸分泌缺失，血清胃泌素水平反馈性升高。胃泌素与上消化道黏膜中的cck
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2受体具有高度亲和力，结合后能够激活细胞增殖、抗凋亡、炎症反应等多种信号通路，诱导酸分泌以及促进肿瘤发生。当人体内胃泌素17处于低值状态时，通常提示患者的胃部存在一些高酸的状况。而当胃泌素17处于高值状态时，则提示患者的胃内部存在一些炎症，患者可能表现出一些高胃泌素血症的发病症状。这种情况可能跟幽门螺旋杆菌感染、胃溃疡以及药物影响有关系。因此，血清胃泌素17能反应胃粘膜细胞功能状态，血清胃泌素17水平可作为萎缩性胃窦胃炎的血清标志物。
4.胃泌素17用胶乳增强免疫比浊法准确度高，根据吸光度的变化可以定量。但是g
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17在离体血液中很不稳定，采血之后就开始快速降解，理论上在2～8℃保存时间只有3h，这意味着，从采血到检测必须在3h内完成，而实际工作中很多医院无法做到3h以内检测，所以临床上会出现很多小于1pmol/l的无效结果。
5.据此，目前急需对现有的胃泌素17测定方法进行改进，以获得一种能够快速检测样本并获得相应准确结果的胃泌素17检测方法。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题在于提供一种能够快速检测样本并获得相应准确结果的胃泌素17胶乳增强比浊法测定试剂盒及其制备使用方法。
7.本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
8.一种胃泌素17胶乳增强比浊法测定试剂盒，包括彼此独立的试剂r1和试剂r2双液体组分；其中，所述试剂r1包括10～100mmol/l缓冲液、0.1～1g/l防腐剂；所述试剂r2包括10～100mmol/l缓冲液、1％w/v g17抗体微球。
9.作为本发明的优选方式之一，所述试剂r1和试剂r2中的缓冲液为tris
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hcl缓冲液、pbs缓冲液、pb缓冲液和mes缓冲液中的一种或多种。
10.作为本发明的优选方式之一，所述试剂r1中的防腐剂为proclin300、叠氮钠中的一种或两种。
11.作为本发明的优选方式之一，所述试剂r2中g17抗体微球的制备方法为：取活化好
的羧基微球与g17抗体进行偶联，偶联后的羧基微球与g17抗体以共价键形式结合，并稳定地存在于所述缓冲液中。
12.作为本发明的优选方式之一，所述羧基微球采用edc作为活化剂进行活化，活化时间15min。
13.作为本发明的优选方式之一，所述活化好的羧基微球与g17抗体分别以1:(5～6)的w/v比偶联混合，偶联时间2h。
14.一种上述胃泌素17胶乳增强比浊法测定试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
15.(2)制备g17抗体微球
16.取活化好的羧基微球与g17抗体进行偶联，偶联后的羧基微球与g17抗体以共价键形式结合，构成g17抗体微球；其中，所述羧基微球采用edc作为活化剂进行活化，活化时间15min；活化好的羧基微球与g17抗体分别以1:(5～6)的w/v比偶联混合，偶联时间2h；
17.(2)配制试剂r1
18.按照试剂r1的组分含量，将缓冲液与防腐剂于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂r1；
19.(3)配制试剂r2
20.按照试剂r2的组分含量，将缓冲液与步骤(1)制得的g17抗体微球于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂r2。
21.一种上述胃泌素17胶乳增强比浊法测定试剂盒的使用方法，包括如下具体步骤：
22.(1)吸取10μl样本，加入150μl试剂r1，37℃孵育5min；
23.(2)再加入50μl试剂r2进行混合，并使其充分反应；
24.(3)l min后读取吸光值al，3min后读取吸光值a2，计算δa；
25.(4)根据吸光度变化值δa计算出样本中胃泌素17含量。
26.作为本发明的优选方式之一，所述步骤(3)中，采用全自动生化分析仪，于主波长505nm测定吸光值。
27.作为本发明的优选方式之一，所述步骤(4)中，依据定标值，根据δa测算样本中胃泌素17含量；所述定标方法为：5点定标，采用全自动生化分析仪进行检测，设置校准品浓度分别为：0pmol/l、15pmol/l、30pmol/l、60pmol/l、120pmol/l。
28.本发明相比现有技术的优点在于：
29.(1)本发明试剂盒使用体外检测血清中胃泌素含量，避免胃镜检测的复杂流程，定量检测确定萎缩性胃炎症状；并且，可用于全自动生化分析仪，方便且省时节约；同时，在试剂制作上也简单方便，适用于大规模生产；
30.(2)本发明可在全自动生化分析仪上使用，成本低廉，且自动化高，节省检测时间；在高稳定性和高精密度情况下，相比同类产品，具有更高的灵敏度和特异性，提升了胃泌素17检测的应用价值。
具体实施方式
31.下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
32.实施例1
33.本实施例的一种胃泌素17胶乳增强比浊法测定试剂盒，包括彼此独立的试剂r1和试剂r2双液体组分；其中，试剂r1包括10mmol/l tris
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hcl缓冲液、0.1g/l proclin300；试剂r2包括10mmol/l tris
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hcl缓冲液、1％w/v g17抗体微球。
34.具体地，在本实施例中，关于g17抗体微球的制备：取活化好的羧基微球与g17抗体进行偶联，偶联后的羧基微球与g17抗体以共价键形式结合，并稳定地存在于tris
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hcl缓冲液中。
35.实施例2
36.本实施例的一种胃泌素17胶乳增强比浊法测定试剂盒，包括彼此独立的试剂r1和试剂r2双液体组分；其中，试剂r1包括100mmol/l pbs缓冲液、1g/l叠氮钠；所述试剂r2包括100mmol/l pbs缓冲液、1％w/v g17抗体微球。
37.具体地，在本实施例中，关于g17抗体微球的制备：取活化好的羧基微球与g17抗体进行偶联，偶联后的羧基微球与g17抗体以共价键形式结合，并稳定地存在于pbs缓冲液中。
38.实施例3
39.本实施例的一种胃泌素17胶乳增强比浊法测定试剂盒，包括彼此独立的试剂r1和试剂r2双液体组分；其中，试剂r1包括50mmol/l mes缓冲液0.5g/l proclin300；所述试剂r2包括50mmol/l mes缓冲液、1％w/v g17抗体微球。
40.具体地，在本实施例中，关于g17抗体微球的制备：取活化好的羧基微球与g17抗体进行偶联，偶联后的羧基微球与g17抗体以共价键形式结合，并稳定地存在于mes缓冲液中。
41.实施例4
42.本实施例的一种上述胃泌素17胶乳增强比浊法测定试剂盒中g17抗体微球的制备方法：
43.清洗：取固含量为10％的羧基微球1.0ml，并加至3.0ml的清洗缓冲液中；20000r/min下离心30min，去上清；用2.5ml清洗缓冲液对羧基微球沉淀物重悬超声。该步骤中，清洗缓冲液采用磷酸盐缓冲液。
44.活化：量取一定量的活化剂按比例加入清洗缓冲液混匀，配制成活化缓冲液，加入到上述清洗好的羧基微球中，混匀，对羧基微球进行活化；再次离心，用偶联缓冲液对胶乳微球沉淀物重悬超声，制得活化胶乳微球。该步骤中，清洗缓冲液和偶联缓冲液采用磷酸盐缓冲液；活化剂采用2％edc 0.25ml，活化时间15min；相应羧基微球与活化剂的比例为1：(10～20)(w/v)，优选为1:15。
45.偶联：取g17抗体与活化好的羧基微球在45℃恒温条件下偶联，制取偶联后的羧基微球。该步骤中，活化好的羧基微球与g17抗体的w/v比分别为1:(5～6)，优选为1:5.5，偶联时间2h。
46.封闭：偶联结束后开始离心，20000r/min下离心30min，去上清；取3.0ml的封闭缓冲液对羧基微球沉淀物重悬超声，然后进行封闭，时间为1h。该步骤中，封闭缓冲液采用bsa、甘氨酸中的一种或多种，优选为1％bsa。
47.实施例5
48.本实施例的一种上述胃泌素17胶乳增强比浊法测定试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
49.(1)制备g17抗体微球
50.按照实施例4方法制备；
51.(2)配制试剂r1
52.按照试剂r1的组分含量，将相应缓冲液与防腐剂于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂r1；
53.(3)配制试剂r2
54.按照试剂r2的组分含量，将相应缓冲液与步骤(1)制得的g17抗体微球于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂r2。
55.实施例6
56.本实施例的一种上述胃泌素17胶乳增强比浊法测定试剂盒的使用方法。
57.分析方法：两点终点法；
58.反应方向：上升反应；
59.校准方式：spline；
60.测定波长：主505nm；
61.测定温度：37℃；
62.样本:试剂r1:试剂r2＝10:150:50(μl)；
63.g17校准品：在血清中加入0pmol/l g17抗原1、15pmol/l g17抗原2、30pmol/l g17抗原3、60pmol/l g17抗原4、120pmol/l g17抗原5，再加入质量比为0.05％的叠氮钠以及5％的蔗糖。
64.测试步骤：
65.(1)吸取10μl样本，加入150μl试剂r1，37℃孵育5min；
66.(2)再加入50μl试剂r2进行混合，并使其充分反应；
67.(3)l min后读取吸光值al，3min后读取吸光值a2，计算δa；
68.(4)根据吸光度变化值δa计算出样本中胃泌素17含量。
69.其中，依据定标值，根据δa测算样本中胃泌素17含量；所述定标方法为：5点定标，采用全自动生化分析仪进行检测，设置校准品浓度分别为：0pmol/l、15pmol/l、30pmol/l、60pmol/l、120pmol/l。
70.实施例7
71.本实施例用以评价上述胃泌素17免疫测定试剂盒的使用效果。
72.1.线性相关性验证：
73.利用上述实施例3配方配制试剂，与国家食品药品监督管理总局认可的某上市公司的胃泌素17检测试剂盒进行对照检测，检测50份临床血清样本。检测结果如下表1，获得了本发明试剂盒与上市某公司在售胃泌素17检测试剂的相关性曲线；通过检测结果显示，两试剂盒的线性相关曲线为y＝1.0000x+0.3315，相关系数r＝0.9900，说明两者具有较大的相关性。
74.表1本发明试剂盒(测试样品)与某上市公司在售胃泌素17检测试剂盒(作为对照)线性相关性比对值
[0075][0076]
2.线性范围验证：
[0077]
配制0
‑
120pmol/l不同浓度胃泌素17校准品，使用本发明试剂盒测定各测试品浓度，以稀释浓度为自变量，以测定结果为因变量求出线性回归方程，计算测定结果的相对偏差。测定与计算结果如表2所示，由表2可知，测定结果与稀释浓度之间的线性回归方程为y＝0.0329+1.0047x，相关系数r＝0.972，说明线性关系良好，线性范围可达120pmol/l。
[0078]
表2本发明试剂盒线性范围验证
[0079][0080]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。