多重氨基酸定量方法及试剂盒研制

1.本发明设计了一种基于质谱技术的氨基酸定量法，可实现氨基酸样品大规模、高准确度和高精密度定量，此外该方法还有其他优点如价格低廉、方法标记简单、标记效率高、无副反应等。该方法可以用于临床诊断、食品样品所含有的氨基酸的定量分析。


背景技术：

2.氨基酸是生命的重要组成部分，是蛋白质的组成单元。人体内重要的氨基酸有40余种，包括20种蛋白质氨基酸以及一些有重要功能的氨基酸，统称为“全谱氨基酸”。具体包含精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、γ
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氨基丁酸、甘氨酸、丝氨酸、牛磺酸、酪氨酸、α
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氨基已二酸、天门冬酰胺、天门冬氨酸、瓜氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、鸟氨酸、半胱氨酸、胱硫醚、同型半胱氨酸、α
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氨基正丁酸、丙氨酸、鹅肌肽、β
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丙氨酸、β
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氨基异丁酸、肌肽、乙醇胺、δ
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羟基赖氨酸、羟化脯氨酸、1
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甲基组氨酸、3
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甲基组氨酸、磷酸乙醇胺、磷酸丝氨酸、脯氨酸、肌氨酸、精氨琥珀酸、羟化瓜氨酸。全谱氨基酸与诸多疾病相关，设计代谢、肿瘤、免疫、心脑血管、神经系统等疾病，也与儿童骨骼发育、激素分泌等相关。除此以外，食品检测中也需要测试氨基酸的含量以确定食品的功效。
3.现有的定量方法主要是衍生法结合液相色谱法、气相色谱
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质谱法以及液相色谱质谱联用方法。液相色谱
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质谱联用方法因样品处理简单，可以同时实现定性定量，得到了更为广泛的应用。液相色谱
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质谱方法的应用均基于稳定同位素标记加入法，稳定同位素的引入既可以通过在样品预处理过程中加入含有13c、15n或者2h元素的氨基酸，以及使用含有这些元素的试剂进行化学标记。然而上述方法检测的成本高、通量低，限制了该方法在临床上的使用。


技术实现要素：

4.为此，我们设计了新型标记方法，利用甲醛和氰基硼氢化钠及其同位素形式进行有机组合，如表1所示，实现了最高八重样品的同时定量分析，单个样品的分析成本不足现有分析方法的1/10。
5.表1含有不同同位素标记的甲醛与氰基硼氢化钠组合标记汇总
[0006][0007]
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0008]
1.内标氨基酸的制备：用8种标记组合任何一种标记标准氨基酸作为内标氨基酸使用，本试剂盒选择dim36标记标准氨基酸。
[0009]
2.质控品的制备：用不同于内标氨基酸的标记试剂标记标准氨基酸，加入到血清干粉中。本试剂盒选择使用dim28标记标准氨基酸，加入内标氨基酸。
[0010]
3.校准品制备：选择dim28，dim30h，dim32h，dim34h和dim36分别标记标准氨基酸，并以一定的浓度梯度混合到一起加入到血清干粉中。
[0011]
4.临床样品氨基酸提取：静脉取血，离心去除血细胞，收集上清。向上清里加入乙腈或甲醇沉淀蛋白，离心取上清，吹干后，复溶并加入标记试剂，使游离氨基酸反应上化学标签。该标记试剂不能与内标氨基酸一样。
[0012]
5.质控品和校准品复溶。加入含乙腈或甲醇，沉淀蛋白，取上清。
[0013]
6.质谱分析：将质控品、校准品的上清用氮气吹干，用色谱的流动相a液进行复溶。临床样品，质控品和校准品分别进行质谱分析。
[0014]
本发明具有如下优点：
[0015]
1.样品预处理简单，该方法的样品预处理过程与常规的样品预处理过程相同。
[0016]
2.标记方法简单、高效、快速而且反应效果高，无副反应，该方法可以在5分钟以内完成样品的标记，标记效率100％。
[0017]
3.该标记方法标记样品成本低，100μmol的氨基酸样品标记价格低，远低于itraq 试剂和直接使用稳定同位素标记的氨基酸的价格。
附图说明：
[0018]
1.图1为氨基酸经使用不同同位素组成的甲醛和氰基硼氢化钠标记后的产物及质量增加值的示意图。
具体实施方式
[0019]
1.内标氨基酸的制备：将10μl 4％
13
cd2o和10μl 0.6mol/l nacnbd3的标记试剂加入到100μl 0.01m酪氨酸水溶液中，室温反应15min，随后加入10μl 1m nh4hco3溶液，反应10min以去除多余的标记试剂。上述反应完的溶液作为内标储备液，用0.1％甲酸将工作液稀释1000倍用作工作液。
[0020]
2.质控品的制备：将10μl 4％ch2o和10μl 0.6mol/l nacnbh3的标记试剂加入到100μl 0.01m酪氨酸水溶液中，室温反应15min，随后加入10μl 1m nh4hco3溶液，反应10min以去除多余的标记试剂，用0.1％甲酸将工作液稀释500倍，取10μl加入到血清干粉。取10μl内标工作液加入到血清干粉中，用0.1ml 0.1％甲酸将血清干粉溶解，加入400μl乙腈沉淀蛋白，15000g离心，去除蛋白，收集上清，氮气吹干，用100μl 0.1％甲酸复溶待用。
[0021]
3.校准品制备：以相同的方法，用dim28，dim30h，dim32h，dim34h和dim36试剂分别标记酪氨酸溶液。并以dim28：dim30h：dim32h：dim34h：dim36＝2:10:50:250:500混合后，加入到100μl的血清溶液中，加入400μl乙腈沉淀蛋白，15000g离心，去除蛋白，收集上清，氮气吹干，用100μl 0.1％甲酸复溶待用。
[0022]
4.临床样品氨基酸提取：静脉取到的血，离心去除血细胞，收集上清。取100μl上清，加入400μl乙腈沉淀蛋白，15000g离心10min，取上清，加入10μl 4％ch2o和 10μl 0.6mol/l nacnbh3，室温反应15min，随后加入10μl 1m nh4hco3溶液，反应10min 以去除多余的标记试剂，加入10μl内标工作液，除盐吹干，用100μl流动相a液复溶，待用。
[0023]
5.质谱分析：临床样品，质控品和校准品分别进行质谱分析。液相色谱条件：带柱温箱(ch
‑
a)的acquity uplc i
‑
class，进样量1μl，柱温：40℃；色谱柱acquity uplcr beh c18,1.7μm,2.1
×
100mm，流速0.2ml/min，流动相a：water+0.1％fa；流动相b： meoh+0.1％fa+2mm ammonium formate。梯度表：
[0024]
time％b曲线0262263.510648064.3264.526
[0025]
质谱条件：xevo tqd；采集模式mrm，母离子210>164；212>166；214>168；216>170； 218>172。极性为esi+；毛细管电压0.5kv；离子源温度150℃；脱溶剂气温度：350℃；锥孔电压16v，碰撞能量16v。
[0026]
数据处理：带targetlynx应用管理软件的masslynx软件4.1版
[0027]
方法评价：
[0028]
1.外标曲线：本方法利用在同一个样品中加入由五种同位素标记的氨基酸，并以不同的浓度梯度混合，克服了多次进样导致定量曲线线性相关系数低，以及耗费大量机时的不足。本例将酪氨酸用dim28，dim30h，dim32h，dim34h和dim36标记，以dim28：dim30h： dim32h：dim34h：dim36＝2:10:50:250:500混合，利用碎片离子峰面积进行定量。
[0029]
2.质控品定量：质控品中dim28标记的氨基酸的含量是内标物dim36标记氨基酸的
2 倍。实测结果为1.98倍，体现极高的定量准确度。
[0030]
3.maaq方法在临床样品分析中的应用
[0031]
从10例体检样品中选择健康人的血清用maaq方法进行分析，得到的酪氨酸的含量为 57.4
±
7.9μmol/l。
[0032]
在本发明的描述中，需要说明的是，术语“上”、“下”、“内”、“外”、“顶/ 底端”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
[0033]
在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“设置有”、“套设/接”、“连接”等，应做广义理解，例如“连接”，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
[0034]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。