同时测定抑菌纸张中五种禁限用物质含量的方法及其用途与流程

1.本发明属于检测技术领域，具体涉及一种同时测定抑菌纸张中五种抑菌禁限用物质含量的方法及其用途。


背景技术：

2.在科技越来越发达、生活质量越来越高的今天，很多消费者要求不同场合的用纸不仅本身无菌而且应具有抑菌功效。这些抑菌纸张主要包括：抑菌餐巾纸、吸油纸、抑菌抽纸、抑菌医护用纸等。
3.抑菌剂是抑菌材料的核心。按成分分类，抑菌剂主要包括：无机抑菌剂、有机抑菌剂、天然抑菌剂。然而，有的供应商出于经济成本等考虑，可能会滥用安全性无法保障的廉价抑菌剂。如果供应商没有如实披露所使用抑菌成分/组分，相关行业也缺少专门针对抑菌纸张中诸多抑菌禁限用物质的测定方法，将致使消费者面临物料供应商可能滥用抑菌剂而带来的安全风险。
4.2016年9月，美国食品和药品管理局(food anddrugadministration，fda)禁止、取缔抑菌皂的消息铺天盖地，一时间弄得人心惶惶。究其根本是fda禁止在抑菌皂中使用卤卡班、三氯卡班、三氯生、六氯酚、三溴沙仑等抑菌化合物。
5.卤卡班，cas号：369
‑
77
‑
7；中文别名：氟甲氯苯脲；哈洛卡班；双氟双氧苯脲等；英文名称：halocarban；化学结构式如图1所示，分子式为c
14
h9cl2f3n2o，分子量为348.0044。因卤卡班具有抗真菌、消毒、防腐作用，常作为抑菌剂用于除臭剂、肥皂以及医护人员洗手液。此外，还作为阳离子表面活性剂应用于洗衣液。然而，因卤卡班具有生殖毒性，美国食品与药品管理局(fda)于2016年宣布禁止在抗菌皂中继续使用卤卡班。欧洲化学品管理局(european chemicals agency，eca)在2016年发布的物质清单中，将卤卡班列为可疑致癌物，涉嫌危害水生环境，且在环境中可能具有持久性和生殖毒性。阿根廷相关机构通过13832/2016号决议，禁止将卤卡班用于在阿根廷注册的抗菌产品(如个人护理产品、化妆品和/或香水产品)。
6.三氯卡班，cas号：101
‑
20
‑
2；中文别名：三氯卡斑；康洁新；保肤洁；三氯卡巴；三氯苯脲；3,4,4'
‑
三氯二苯等；英文名称：triclocarban(简称tcc)；化学结构式如图2所示，分子式为c
13
h9cl3n2o，分子量为313.978046。三氯卡班作为抗菌剂被广泛应用于除臭剂、洗手液、牙膏、洗发剂、香皂、剃须膏等个人护理产品中，此外也可广泛应用于医疗消毒器械及纺织品抗菌防霉。但是，近年国内外研究结果表明，三氯卡班具有高亲脂性，可在体内聚集和积累；是一种新型的内分泌干扰物，可能引发包括癌症、生殖功能障碍和发育异常等病症。我国《化妆品安全技术规范》(2015版)规定三氯卡班作为防腐剂在化妆品中使用的最大允许浓度为0.2％。2016年9月，美国食品与药品管理局(fda)宣布禁止在抗菌洗手液/肥皂中使用三氯卡班。
7.三氯生，cas号：3380
‑
34
‑
5；中文别名：二氯苯氧氯酚；三氯新；克力恩；三氯沙等；英文名称：triclosan(简称：tcs)。化学结构式如图3所示，分子式为c
12
h7cl3o2，分子量为
287.951163；是国际上公认的特效杀菌剂品种。目前已经被广泛应用于高效药皂(卫生香皂、卫生洗液)、除腋臭(脚气雾剂)、消毒洗手液、伤口消毒喷雾剂、医疗器械消毒剂、卫生洗面奶(膏)、空气清新剂及冰箱除臭剂等日用化学品中，也用于卫生织物的整理和塑料的防腐处理，高纯度的可用于治疗牙龈炎、牙周炎及口腔溃疡等的疗效牙膏及漱口水中。目前已有研究表明，三氯生对动物有潜在的内分泌干扰效应，且存在一定的遗传毒性。我国《化妆品安全技术规范》(2015版)规定：三氯生作为防腐剂在化妆品中使用的最大允许浓度为0.3％。2014年5月22日，美国明尼苏达州已率先禁止出售任何含有三氯生的清洗或个人护理消费产品。2014年6月16日，欧洲化学品管理局将三氯生列入生物杀灭剂产品法规下的替代候选物质进行公众咨询。2016年9月，美国食品与药品管理局宣布禁止在抗菌洗手液/肥皂中使用三氯生。
8.六氯酚，cas号：70
‑
30
‑
4；中文别名：六氯芬；灭菌酚等；英文名称：hexachlorophene；化学结构式如图4所示，分子式为c
13
h6cl6o2，分子量为403.8499；在碱性条件下，对革兰阳性菌有效。20世纪50年代起，西欧和美国广泛将六氯酚作为杀菌剂添加在肥皂、洗发剂、生发水、座疮药、除臭药、牙膏、阴道清洁剂、剃须膏、婴儿扑粉等商品中。美国还常常将3％六氯酚乳剂用于外科洗手、婴儿沐浴、术后创口护理、烧伤护理等。然而，近年国内外研究结果表明：氯酚类物质有雌激素效应，有致突变性、致癌性等高毒性。生物体过量摄入六氯酚可抑制中枢系统，导致神经系统紊乱，严重的表现为意识丧失、呼吸抑制等症状。我国《化妆品安全技术规范》(2015版)及《欧盟化妆品规例》等均规定六氯酚为化妆品禁用组分。2016年9月，美国食品与药品管理局(fda)宣布禁止在抗菌洗手液/肥皂中使用六氯酚。
9.三溴沙仑，cas号：87
‑
10
‑
5；中文别名：三溴洒兰；三溴柳苯胺；3,4',5
‑
三溴水杨酰苯胺；3,4',5
‑
三溴水杨酸苯胺；3,5
‑
二溴代水杨酰对溴苯胺等；英文名称：tribromsalan；化学结构式如图5所示，分子式为c
13
h8br3no2，分子量为446.8105；具有化学性质稳定、抗菌广谱、高效的特点，被广泛应用于化工产品及农用饲料的防霉处理。然而，人体摄入这类物质后经血液循环分布于皮肤表面，接触日光照射时会发生光变态反应，导致日光荨麻疹或接触性光过敏性皮炎，危害人体健康。我国《化妆品安全技术规范》(2015版)及《欧盟化妆品规例》等都将三溴沙仑列为化妆品禁用组分。2016年9月，美国食品与药品管理局(fda)宣布禁止在抗菌洗手液/肥皂中使用三溴沙仑。
10.目前，同时测定抑菌纸张中卤卡班、三氯卡班、三氯生、六氯酚和三溴沙仑等多种抑菌禁限用物质含量的方法尚属技术空白。
11.arno h.a.heyn a等人于1982年建立了通过气相
‑
液相色谱(glc)测定抑菌皂中卤卡班的方法(international journal ofenvironmental analytical chemistry.1982,11(2):131
‑
137)，该方法需要对目标分析物进行化学衍生，前处理较繁琐，工作量大，检出限为78ng/ml，灵敏度不高。
12.现有的分别测定六氯酚、三溴沙仑的方法主要适用于化妆品、食品中相关物质的检测，不适用于纸张基质中相关物质的检测。
13.徐腾洋团队建立的高效液相色谱测定食品包装纸中三氯生和三氯卡班的方法(食品安全导刊.2020,12,139
‑
140)，采用的检测器是二极管阵列检测器，线性范围分别为0.2～100mg/l和0.05～100mg/l，定量限分别为0.04mg/kg和0.01mg/kg，方法灵敏度不高；且其
前处理需要旋蒸、定容等，程序繁琐且可能影响化合物的稳定性，从而影响目标化合物含量测定值的准确性。
14.由此可见，目前国内外没有关于采用超高效液相色谱
‑
质谱法(uplc
‑
esi
‑
ms/ms)测定卤卡班的方法报道；也没有关于测定纸张基质中卤卡班、六氯酚、三溴沙仑的方法报道；更没有比较完备、快捷的可实现同时测定抑菌纸张中卤卡班、三氯卡班、三氯生、六氯酚和三溴沙仑这五种卤代抑菌禁限用物质含量的方法报道。
15.因此，现阶段有必要建立一种简单快捷、高效灵敏、适用范围广的可同时测定抑菌纸张中卤卡班、三氯卡班、三氯生、六氯酚、三溴沙仑这五种卤代抑菌禁限用物质含量的方法，为抑菌纸张的安全风险评估提供技术支持，为抑菌纸张消费者享有安全权提供技术保障。
16.为了解决以上问题，提出本发明。


技术实现要素：

17.本发明的目的是提供一种能够同时测定抑菌纸张中卤卡班、三氯卡班、三氯生、六氯酚、三溴沙仑这五种卤代抑菌禁限用物质含量的方法，以克服现有技术缺陷，从而为抑菌纸张的安全风险评估提供技术支持，为消费者享有安全权提供技术保障。
18.本发明第一方面提供一种同时测定抑菌纸张中五种抑菌禁限用物质含量的方法，所述五种抑菌禁限用物质为卤卡班、三氯卡班、三氯生、六氯酚和三溴沙仑五种目标化合物，所述方法包括以下步骤：
19.步骤s1，同时含五种抑菌禁限用物质的系列混合标准工作溶液的配制：使用80％vol的甲醇水溶液配制同时含卤卡班、三氯卡班、三氯生、六氯酚或三溴沙仑的系列混合标准工作溶液；
20.对同一混合标准工作溶液而言，卤卡班、三氯卡班、六氯酚和三溴沙仑的浓度相同，三氯生的浓度为卤卡班、三氯卡班、六氯酚和三溴沙仑对应浓度的8
‑
12倍；
21.步骤s2，样品前处理：裁切抑菌纸张样品得到试样，试样应包含一个单边；将裁剪下来的试样剪成0.5cm
×
0.5cm的碎片，混合均匀，置于干净的密封袋中待用；称取待测试样，置于具塞三角瓶中，加入色谱纯甲醇v ml，超声提取20～40min；静置3～7min，移取2～3ml萃取液于离心管中，离心3～7min；移取1ml上清液，经0.22μm有机相滤膜过滤，获待测样品滤液，待超高效液相色谱
‑
电喷雾电离源四极杆质谱检测超高效液相色谱
‑
电喷雾电离源四极杆质谱(uplc
‑
esi
‑
ms/ms)检测；
22.步骤s3，空白实验：在不加待测纸张样品的情况下，执行步骤s2，获待测空白样品滤液，待超高效液相色谱
‑
电喷雾电离源四极杆质谱(uplc
‑
esi
‑
ms/ms)检测；
23.步骤s4，标准工作曲线的绘制：通过采用超高效液相色谱
‑
电喷雾电离源四极杆质谱(uplc
‑
esi
‑
ms/ms)测定步骤s1所述系列混合标准工作溶液中各目标化合物的峰面积，以每个目标化合物的浓度为横坐标，该目标化合物的峰面积为纵坐标，进行线性回归以绘制标准工作曲线；
24.步骤s5，样品中各目标化合物的含量测定：采用超高效液相色谱
‑
电喷雾电离源四极杆质谱(uplc
‑
esi
‑
ms/ms)测定s2所述待测样品滤液中各目标化合物的峰面积，并根据步骤s4所述标准工作曲线计算所述待测样品滤液中各目标化合物的浓度c；
25.步骤s6，空白样品中各目标化合物的含量测定：采用超高效液相色谱
‑
电喷雾电离源四极杆质谱(uplc
‑
esi
‑
ms/ms)测定s3所述待测空白样品滤液中各目标化合物的峰面积，并根据步骤s4所述标准工作曲线计算所述待测空白样品滤液中各目标化合物的浓度c0；
26.步骤s7，抑菌纸张样品中各目标化合物含量的结果计算：根据以下公式计算所述待测抑菌纸张样品中各目标化合物的含量；
[0027][0028]
式中，
[0029]
x表示待测抑菌纸张样品中各目标化合物的含量，单位为μg/kg；
[0030]
c表示由标准工作曲线得出的待测样品滤液中对应目标化合物的浓度，单位为ng/ml；
[0031]
c0表示由标准工作曲线得出的待测空白样品滤液中对应目标化合物的浓度，单位为ng/ml；
[0032]
v表示萃取液的体积，单位为ml；
[0033]
m表示待测抑菌纸张样品的质量，单位为g；
[0034]
∫表示稀释因子；若待测试样溶液中目标化合物的浓度未超出混合标准工作溶液最大浓度，则稀释因子取1；若待测试样溶液中目标化合物的浓度超出混合标准工作溶液最大浓度，则应将待测液用甲醇调整稀释后再测定，若稀释至2倍，则稀释因子取2，以此类推；
[0035]
以多次平行测定结果的算术平均值为最终测定结果，精确至0.01μg/kg；
[0036]
多次平行测量结果的相对平均偏差应小于10％。
[0037]
优选地，在所述步骤s4、所述步骤s5和所述步骤s6中，超高效液相色谱
‑
电喷雾电离源四极杆质谱方法的液相色谱条件包括：色谱柱为100mm
×
2.1mm，1.8μm的acquity uplc hss t3色谱柱；进样量为5μl；流速为0.3ml/min；柱温为40℃；进样器温度为20℃；流动相a为甲醇，流动相b为0.1％vol甲酸水溶液；梯度洗脱条件包括：0～1.0min，流动相a的占比为80％vol～85％vol；1.0～2.0min，流动相a的占比为85％vol；2.0～4.0min，流动相a的占比为85％vol～90％vol；4.0～6.0min，流动相a的占比为90％vol；6.0～6.5min，流动相a的占比为90％vol～100％vol；6.5min～7.0min，流动相a的占比为100％vol～80％vol；7.0min～8.0min，流动相a的占比为80％vol。
[0038]
在所述步骤s4、所述步骤s5和所述步骤s6中，超高效液相色谱
‑
电喷雾电离源四极杆质谱方法的质谱条件包括：离子源为电喷雾电离源；扫描方式为负离子扫描；毛细管电压为3kv；萃取锥孔电压为5v；rf射频质谱电压为0.5v；离子源温度为120℃；脱溶剂气为氮气，纯度不小于99.99％；脱溶剂气温度为500℃；脱溶剂气流量为600l/hr；碰撞气为氩气；碰撞室压力为3.80e
‑3mbar；光电倍增管电压为650v；检测方式为多反应监测；离子对的驻留监测时间为50ms。
[0039]
优选地，在步骤s1中，同时含卤卡班、三氯卡班、三氯生、六氯酚或三溴沙仑的系列混合标准工作溶液中，卤卡班、三氯卡班、六氯酚和三溴沙仑的浓度分别为：2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、30ng/ml、50ng/ml、70ng/ml、100ng/ml、150ng/ml、200ng/ml；三氯生的浓度为卤卡班、三氯卡班、六氯酚和三溴沙仑对应浓度的8
‑
12倍；即三氯生的浓度分别为16～24ng/ml、40～60ng/ml、80～120ng/ml、240～360ng/ml、400～600ng/ml、560～840ng/ml、
800～1200ng/ml、1200～1800ng/ml、1600～2400ng/ml。
[0040]
优选地，在所述步骤s4、所述步骤s5和所述步骤s6中，各目标化合物对应的超高效液相色谱
‑
电喷雾电离源四极杆质谱方法的保留时间及多反应监测关键参数详见下表：
[0041][0042][0043]
注：*为定量离子。
[0044]
本发明第二方面提供第一方面所述的测定抑菌纸张中五种抑菌禁限用物质含量的方法的用途，此方法用于同时快速测定复杂混合体系中的卤卡班、三氯卡班、三氯生、六氯酚和三溴沙仑，检出限为0.01～10.00ng/ml，定量限为0.02～26.00ng/ml。
[0045]
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
[0046]
1.本发明提供的测定方法适用于纸张基质中五种卤代抑菌禁限用物质含量的同时测定。具体操作时，只需按照优选的液相色谱条件、质谱条件、尤其是优选的多反应监测关键参数配置超高效液相色谱
‑
电喷雾电离源四极杆质谱相关条件和参数，同一个样品只需一次进样即可测出五种卤代抑菌禁限用物质含量；
[0047]
2.与现有的分别测定六氯酚、三溴沙仑等单目标物质的方法相比，以及与现有的同时测定三氯生和三氯卡班的方法相比，本发明针对同一个样品只需经过一次前处理，一次进样就可同时测定出五种卤代抑菌禁限用物质的含量，可使日分析样品量至少提高3～4倍，因此，本发明的方法适用于大批量样品的分析；
[0048]
3.本发明提供的测定方法具有更高的专属性和抗干扰能力，即使目标化合物的色谱峰不能完全彻底分开，也能对复杂混合体系中目标化合物进行准确测定；
[0049]
4.本发明提供的测定方法对五种卤代抑菌禁限用物质的测定均具有良好的线性关系，检出限为0.01～10.00ng/ml，定量限为0.02～26.00ng/ml，有利于复杂混合体系中五种卤代超痕量(“超痕量”是指被测定物质含量<1μg/ml)组分的快速灵敏定量检测；
[0050]
5.本发明提供的测定方法之样品前处理简单，方法平均加标回收率为83.35％～96.69％，经6次平行测定结果的相对标准偏差均低于10％，其较好的回收率及重现性保证了测定结果的可靠性；
[0051]
6.本发明提供的测定方法不用对目标分析物进行化学衍生，不用旋蒸，目标化合物的稳定性不受影响。因此，本发明提供的测定方法所具有的简单快捷、高效灵敏、适用范围广的特点，可为抑菌纸张的安全风险评估提供技术支持，为抑菌纸张消费者享有安全权提供技术保障。
附图说明
[0052]
图1为本发明所涉及的卤卡班的结构式；
[0053]
图2为本发明所涉及的三氯卡班的结构式；
[0054]
图3为本发明所涉及的三氯生的结构式；
[0055]
图4为本发明所涉及的六氯酚的结构式；
[0056]
图5为本发明所涉及的三溴沙仑的结构式；
[0057]
图6为本发明提供的测定抑菌纸张中五种卤代抑菌禁限用物质含量的方法之实施例流程图；
[0058]
图7为本发明实施例所涉及的浓度为100ng/ml的混合标准工作溶液之卤卡班uplc
‑
esi
‑
ms/ms总离子流色谱图(tic)；
[0059]
图8为本发明实施例所涉及的浓度为100ng/ml的混合标准工作溶液之卤卡班uplc
‑
esi
‑
ms/ms定量离子色谱图(mrm)；
[0060]
图9为本发明实施例所涉及的浓度为100ng/ml的混合标准工作溶液之卤卡班uplc
‑
esi
‑
ms/ms定性离子色谱图(mrm)；
[0061]
图10为本发明实施例所涉及的浓度为100ng/ml的混合标准工作溶液之三氯卡班uplc
‑
esi
‑
ms/ms总离子流色谱图(tic)；
[0062]
图11为本发明实施例所涉及的浓度为100ng/ml的混合标准工作溶液之三氯卡班的uplc
‑
esi
‑
ms/ms定量离子色谱图(mrm)；
[0063]
图12为本发明实施例所涉及的浓度为100ng/ml的混合标准工作溶液之三氯卡班uplc
‑
esi
‑
ms/ms定性离子色谱图(mrm)；
[0064]
图13为本发明实施例所涉及的浓度为1000ng/ml的混合标准工作溶液之三氯生uplc
‑
esi
‑
ms/ms总离子流色谱图(tic)；
[0065]
图14为本发明实施例所涉及的浓度为1000ng/ml的混合标准工作溶液之三氯生uplc
‑
esi
‑
ms/ms定量离子色谱图(mrm)；
[0066]
图15为本发明实施例所涉及的浓度为1000ng/ml的混合标准工作溶液之三氯生uplc
‑
esi
‑
ms/ms定性离子色谱图(mrm)；
[0067]
图16为本发明实施例所涉及的浓度为100ng/ml的混合标准工作溶液之六氯酚uplc
‑
esi
‑
ms/ms总离子流色谱图(tic)；
[0068]
图17为本发明实施例所涉及的浓度为100ng/ml的混合标准工作溶液之六氯酚uplc
‑
esi
‑
ms/ms定量离子色谱图(mrm)；
[0069]
图18为本发明实施例所涉及的浓度为100ng/ml的混合标准工作溶液之六氯酚
uplc
‑
esi
‑
ms/ms定性离子色谱图(mrm)；
[0070]
图19为本发明实施例所涉及的浓度为100ng/ml的混合标准工作溶液之三溴沙仑uplc
‑
esi
‑
ms/ms总离子流色谱图(tic)；
[0071]
图20为本发明实施例所涉及的浓度为100ng/ml的混合标准工作溶液之三溴沙仑uplc
‑
esi
‑
ms/ms定量离子色谱图(mrm)；
[0072]
图21为本发明实施例所涉及的浓度为100ng/ml的混合标准工作溶液之三溴沙仑uplc
‑
esi
‑
ms/ms定性离子色谱图(mrm)。
具体实施方式
[0073]
下面对本发明通过实施例作进一步说明，但不仅限于本实施例。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件使用通用设备、材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例和对比例中所需要的原料均为市售。
[0074]
实施例1
[0075]
一种同时测定抑菌纸张中五种卤代抑菌禁限用物质含量的方法，包括以下步骤：
[0076]
1仪器、试剂和材料
[0077]
仪器：waters acquitytm uplc超高效液相色谱仪串联uplc quattro premi xe质谱仪(美国waters公司)；acquity uplc hss t3色谱柱(2.1mm
×
100mm，1.8μm，美国waters公司)；p 300h超声清洗器(瑞士elma公司)；hyq
‑
2110旋窝混匀器(美国crystal公司)；mettler tolodo xp 504电子分析天平(瑞士mettler tolodo公司，感量为0.1mg)；bcd
‑
620wdbf冰箱(青岛海尔股份有限公司)；diret uv3纯水仪(美国millipore公司)；涡漩振荡器，使用转速500r/min；离心机，使用转速5000r/min；各种规格移液管、移液枪、容量瓶、具塞三角瓶和离心管。
[0078]
试剂：本发明所用的试剂除特殊要求外，应使用分析纯级或以上试剂。卤卡班(halocarban，cas号：369
‑
77
‑
7；英国alfa aesar标准品，纯度99.7％)；三氯卡班(triclocarban，cas号：101
‑
20
‑
2；德国dr.ehrenstorfer标准品，纯度99.08％)；三氯生(triclosan，cas号：3380
‑
34
‑
5；德国dr.ehrenstorfer标准品，纯度99.5％)；六氯酚(hexachlorophene，cas号：70
‑
30
‑
4；德国dr.ehrenstorfer标准品，纯度99.0％)；三溴沙仑(tribromsalan，cas号：87
‑
10
‑
5；德国dr.ehrenstorfer标准品，纯度97.8％)；甲醇(hplc级，德国merck公司)；甲酸(lc
‑
ms级，中国百灵威科技有限公司)；水，gb/t6682，一级。
[0079]
材料：本发明实施例所检测的抑菌纸张样品(包括：抑菌餐巾、抑菌吸油纸、抑菌抽纸等)均购于市场。
[0080]
2实验方法
[0081]
如图6所示，本实施例提供的同时测定抑菌纸张中五种卤代抑菌禁限用物质含量的方法在实际执行过程中，具体包括如下步骤：
[0082]
步骤s1，同时含五种卤代抑菌禁限用物质之系列混合标准工作溶液的配制，所述五种卤代抑菌禁限用物质为卤卡班、三氯卡班、三氯生、六氯酚和三溴沙仑这五种目标化合物；
[0083]
步骤s1
‑
1，单一标准品储备溶液的配制：分别准确称取10mg(精确至0.1mg)卤卡
班、三氯卡班、三氯生、六氯酚和三溴沙仑于10ml棕色容量瓶中，用80％vol甲醇水溶液定容，配制成浓度为1mg/ml的卤卡班、三氯卡班、三氯生、六氯酚、三溴沙仑单一标准品储备溶液。在0℃～4℃条件下密封避光贮存，有效期6个月；
[0084]
步骤s1
‑
2，混合标准储备溶液的配制：分别准确移取经过步骤s1
‑
1得到的卤卡班单一标准品储备溶液200μl、三氯卡班单一标准品储备溶液200μl、六氯酚单一标准品储备溶液200μl和三溴沙仑单一标准品储备溶液200μl和三氯生单一标准品储备溶液2000μl于同一个100ml棕色容量瓶中，用80％vol甲醇水溶液稀释定容，配制成混合标准储备溶液，其中，卤卡班、三氯卡班、六氯酚和三溴沙仑的质量浓度相同，为2000ng/ml，三氯生的浓度为20000ng/ml。在0℃～4℃条件下密封避光贮存，有效期3个月；
[0085]
步骤s1
‑
3，系列混合标准工作溶液的配制：根据样品实际含量，分别移取经过步骤s1
‑
2得到的不同体积的混合标准储备溶液，用80％vol甲醇水溶液定容，逐级稀释成具有不同浓度梯度的系列混合标准工作溶液；
[0086]
示例性地，分别准确移取经过步骤s1
‑
2得到的10μl、25μl、50μl、150μl、250μl、350μl、500μl、750μl、1000μl混合标准工作溶液于不同的10ml容量瓶中，用80％vol甲醇水溶液定容，即得系列混合标准工作溶液，现配现用。所配制的系列混合标准工作溶液中卤卡班、六氯酚、三溴沙仑、三氯卡班的浓度均分别为2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、30ng/ml、50ng/ml、70ng/ml、100ng/ml、150ng/ml、200ng/ml；三氯生的浓度梯度分别为20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、300ng/ml、500ng/ml、700ng/ml、1000ng/ml、1500ng/ml、2000ng/ml(即：各混合标准工作溶液中，三氯生浓度为其它成分对应浓度的10倍)；
[0087]
经过步骤s1
‑
3得到的系列混合标准工作溶液包括第一混合标准工作溶液、第二混合标准工作溶液、第三混合标准工作溶液、第四混合标准工作溶液、第五混合标准工作溶液、第六混合标准工作溶液、第七混合标准工作溶液、第八混合标准工作溶液和第九混合标准工作溶液；其中，在所述第一混合标准工作溶液中，卤卡班、六氯酚、三溴沙仑、三氯卡班的浓度均为2ng/ml，三氯生的浓度为20ng/ml；在所述第二混合标准工作溶液中，卤卡班、六氯酚、三溴沙仑、三氯卡班的浓度均为5ng/ml，三氯生的浓度为50ng/ml；在所述第三混合标准工作溶液中，卤卡班、六氯酚、三溴沙仑、三氯卡班的浓度均为10ng/ml，三氯生的浓度为100ng/ml；在所述第四混合标准工作溶液中，卤卡班、六氯酚、三溴沙仑、三氯卡班的浓度均为30ng/ml，三氯生的浓度为300ng/ml；在所述第五混合标准工作溶液中，卤卡班、六氯酚、三溴沙仑、三氯卡班的浓度均为50ng/ml，三氯生的浓度为500ng/ml；在所述第六混合标准工作溶液中，卤卡班、六氯酚、三溴沙仑、三氯卡班的浓度均为70ng/ml，三氯生的浓度为700ng/ml；在所述第七混合标准工作溶液中，卤卡班、六氯酚、三溴沙仑、三氯卡班的浓度均为100ng/ml，三氯生的浓度为1000ng/ml；在所述第八混合标准工作溶液中，卤卡班、六氯酚、三溴沙仑、三氯卡班的浓度均为150ng/ml，三氯生的浓度为1500ng/ml；在所述第九混合标准工作溶液中，卤卡班、六氯酚、三溴沙仑、三氯卡班的浓度均为200ng/ml，三氯生的浓度为2000ng/ml；
[0088]
步骤s2，样品前处理：裁切长200mm，宽40mm的抑菌纸张样品(应包含一个单边)；将裁剪下来的试样剪成约0.5cm
×
0.5cm的碎片，混合均匀，置于干净的密封袋中待用，每个试样不少于5g；准确称取1.0g待测试样，精确至0.1mg，置于100ml具塞三角瓶中，加入40ml色谱纯甲醇，超声提取30min；静置5min，移取2～3ml萃取液于离心管中，以5000r/min速率离
心5min；移取1ml上清液，经0.22μm有机相滤膜过滤，获待测样品滤液待超高效液相色谱
‑
电喷雾电离源四极杆质谱检测；
[0089]
步骤s3，空白实验：在不加待测纸张样品的情况下，执行步骤s2，获待测空白样品滤液，待超高效液相色谱
‑
电喷雾电离源四极杆质谱检测；
[0090]
步骤s4，标准工作曲线的绘制：通过采用超高效液相色谱
‑
电喷雾电离源四极杆质谱测定步骤s1所述系列混合标准工作溶液中各目标化合物的峰面积，以每个目标化合物的浓度为横坐标，该目标化合物的峰面积为纵坐标，进行线性回归以绘制标准工作曲线；
[0091]
步骤s5，样品中各目标化合物的含量测定：采用超高效液相色谱
‑
电喷雾电离源四极杆质谱测定s2所述待测样品滤液中各目标化合物的峰面积，并根据步骤s4所述标准工作曲线计算所述待测样品滤液中各目标化合物的浓度c(外标法)；
[0092]
步骤s6，空白样品中各目标化合物的含量测定：采用超高效液相色谱
‑
电喷雾电离源四极杆质谱测定s3所述待测空白样品滤液中各目标化合物的峰面积，并根据步骤s4所述标准工作曲线计算所述待测空白样品滤液中各目标化合物的浓度c0(外标法)。
[0093]
每个样品按步骤s5平行测定两次，每批样品按步骤s3做一组空白实验。
[0094]
在所述步骤s4、所述步骤s5和所述步骤s6中，超高效液相色谱
‑
电喷雾电离源四极杆质谱方法的液相色谱条件包括：色谱柱为100mm
×
2.1mm，1.8μm的acquity uplc hss t3色谱柱；进样量为5μl；流速为0.3ml/min；柱温为40℃；进样器温度为20℃；流动相a为甲醇，流动相b为0.1％vol甲酸水溶液；梯度洗脱条件包括：0～1.0min，流动相a的占比为80％vol～85％vol；1.0～2.0min，流动相a的占比为85％vol；2.0～4.0min，流动相a的占比为85％vol～90％vol；4.0～6.0min，流动相a的占比为90％vol；6.0～6.5min，流动相a的占比为90％vol～100％vol；6.5min～7.0min，流动相a的占比为100％vol～80％vol；7.0min～8.0min，流动相a的占比为80％vol(见表1)。
[0095]
表1梯度洗脱条件
[0096][0097]
在所述步骤s4、所述步骤s5和所述步骤s6中，超高效液相色谱
‑
电喷雾电离源四极杆质谱的质谱条件包括：离子源为电喷雾电离源(esi)；扫描方式为负离子扫描(esi
‑
)；毛细管电压为3kv；萃取锥孔电压为5v；rf射频质谱电压为0.5v；离子源温度为120℃；脱溶剂气为氮气，纯度不小于99.99％；脱溶剂气温度为500℃；脱溶剂气流量为600l/hr；碰撞气为氩气；碰撞室压力为3.80e
‑3mbar；光电倍增管电压为650v；检测方式为多反应监测(mrm)；离
子对的驻留监测时间为50ms。
[0098]
在所述多反应监测(mrm)中，由于目前没有关于卤卡班的质谱分析方法报道，其质谱条件需要在对结构进行分析的基础上进行摸索优化。考虑到卤卡班分子中脲基上的两个c
‑
n键活泼，当卤卡班在质谱仪碰撞池中与ar2发生离子
‑
分子碰撞反应后，这两个c
‑
n键很容易发生断裂，且在含苯环的不同碎片中，与苯环相连的n原子上的孤对电子容易和苯环形成共轭结构，推测所形成的不同离子碎片很容易带负电荷。据此，计算负离子模式(esi
‑
)下可能出现的母离子、子离子之相对精确质量，从而预测负离子扫描模式(esi
‑
)下卤卡班应出现m/z 347/194及m/z 347/126离子对。结果显示，以负离子扫描模式(esi
‑
)对卤卡班进行母离子扫描，的确出现m/z 346.75离子峰(如图7所示)；相继在负离子模式(esi
‑
)下进行子离子扫描，的确出现m/z 193.94和m/z 126.03两个子离子峰，且离子峰稳定(如图8和图9所示)。正离子模式(esi
+
)扫描，未出现预期离子对，而出现的其它碎片离子不稳定。因此，卤卡班的质谱分析可采用电喷雾负离子模式(esi
‑
)进行多反应监测(mrm)。
[0099]
另外，其它目标化合物的多反应监测(mrm)质谱条件也需要根据各对应化合物结构及仪器实际情况进行优化，优化后各目标化合物对应的保留时间及多反应监测(mrm)关键参数详见表2。
[0100]
表2各目标化合物的uplc
‑
esi
‑
ms/ms保留时间及多反应监测(mrm)参数
[0101][0102][0103]
注：*为定量离子。
[0104]
图7～图9分别为卤卡班的uplc
‑
esi
‑
ms/ms总离子流色谱图(tic)、定量离子色谱图(mrm)和定性离子色谱图(mrm)；图10～图12分别为三氯卡班的uplc
‑
esi
‑
ms/ms总离子流色谱图(tic)、定量离子色谱图(mrm)和定性离子色谱图(mrm)；图13～图15分别为三氯生的uplc
‑
esi
‑
ms/ms总离子流色谱图(tic)、定量离子色谱图(mrm)和定性离子色谱图(mrm)；图
16～图18分别为六氯酚的uplc
‑
esi
‑
ms/ms总离子流色谱图(tic)、定量离子色谱图(mrm)和定性离子色谱图(mrm)；图19～图21分别为三溴沙仑的uplc
‑
esi
‑
ms/ms总离子流色谱图(tic)、定量离子色谱图(mrm)和定性离子色谱图(mrm)。
[0105]
在本发明的测定抑菌纸张中五种卤代抑菌禁限用物质含量的方法之一种实施方式中，所述步骤s4具体包括：
[0106]
步骤s4
‑
1，采用超高效液相色谱
‑
电喷雾电离源四极杆质谱对步骤s1
‑
3各所述系列混合标准工作溶液进行分析测定，得到每个目标化合物的峰面积，以每个目标化合物的浓度为横坐标，该目标化合物的峰面积为纵坐标，进行线性回归以绘制标准工作曲线，其相关系数的平方r2≥0.95；
[0107]
步骤s4
‑
2，根据信噪比为3(s/n＝3)所对应的各目标化合物浓度确定方法的检出限(lod)；
[0108]
步骤s4
‑
3，根据信噪比为10(s/n＝10)所对应的各目标化合物的浓度确定方法的定量限(loq)。
[0109]
各目标化合物的线性回归方程、线性范围、相关系数的平方(r2)、检出限和定量限见表3。
[0110]
表3目标化合物的回归方程、线性范围、相关系数的平方(r2)、检出限和定量限
[0111][0112][0113]
结果表明，该方法对卤卡班、三氯卡班、六氯酚的测定在2.00～200.00ng/ml浓度范围内线性良好(r2≥0.99)，对三溴沙仑的测定在10.00～200.00ng/ml浓度范围内线性良好(r2≥0.95)，对三氯生的测定在30.00～2000.00ng/ml浓度范围内线性良好(r2≥0.95)。该方法对卤卡班、三氯卡班、三氯生、六氯酚、三溴沙仑这五种卤代抑菌禁限用物质均具有较低的检出限和定量限，其中卤卡班的检出限为0.01ng/ml，定量限为0.02ng/ml；三氯卡班的检出限为0.60ng/ml，定量限为2.00ng/ml；三氯生的检出限为10.00ng/ml，定量限为26.00ng/ml；六氯酚的检出限为0.60ng/ml，定量限为2.00ng/ml；三溴沙仑的检出限为3.00ng/ml，定量限为10.00ng/ml。因此，本发明的测定方法的检出限为0.01～10.00ng/ml，定量限为0.02～26.00ng/ml。
[0114]
进一步地，在具体实现中，每进样20次后需加入一个中等浓度的混合标准工作溶液，如果测定值与原值的相对偏差超过10％，则需重新绘制标准工作曲线。
[0115]
根据待测样品滤液中目标化合物的定量离子峰面积计算待测抑菌纸张样品中对
应目标化合物的含量时，每种被测组分选择1个母离子，2个或2个以上子离子，在相同的实验条件下，待测样品滤液中目标化合物的相对保留时间与混合标准工作溶液中对应目标化合物的保留时间偏差在
±
2.5％之内；且待测样品滤液对应的谱图中各组分特征离子的相对丰度与浓度临近的混合标准工作溶液中对应的特征离子的相对丰度进行比较，当相对丰度>50％时，允许偏差
±
20％，当相对丰度在20％～50％时，允许偏差
±
25％，当相对丰度在10％～20％时，允许偏差
±
30％，当相对丰度<10％时，允许偏差
±
50％。
[0116]
若待测样品滤液的浓度超出混合标准工作溶液的最大浓度，则应将待测样品滤液用甲醇调整稀释倍数后再测定。
[0117]
步骤s7，抑菌纸张样品中各目标化合物含量的结果计算：采用以下公式计算所述待测抑菌纸张样品中各目标化合物的含量，
[0118][0119]
式中，
[0120]
x表示待测抑菌纸张样品中各目标化合物的含量，单位为μg/kg；
[0121]
c表示由标准工作曲线得出的待测样品滤液中对应目标化合物的浓度，单位为ng/ml；
[0122]
c0表示由标准工作曲线得出的空白滤液中对应目标化合物的浓度，单位为ng/ml；
[0123]
v表示萃取液的体积，单位为ml；本实施例取40；
[0124]
m表示待测抑菌纸张样品的质量，单位为克g；
[0125]
∫表示稀释因子；若待测试样溶液的浓度未超出混合标准工作溶液最大浓度，则稀释因子取1；若待测试样溶液的浓度超出混合标准工作溶液最大浓度，则应将待测液用甲醇调整稀释后再测定，若稀释至2倍，则稀释因子取2，以此类推；本实施例无稀释，取1。
[0126]
以两次平行测定结果的算术平均值为最终测定结果，精确至0.01μg/kg。两次平行测量结果的相对平均偏差应小于10％。
[0127]
实施例2加标回收实验——方法准确性及精密度验证
[0128]
进一步地，为了验证本发明测定方法的准确性及精密度，还进行了加标回收试验。
[0129]
具体地，准备浓度分别为3ng/ml(低浓度)、100ng/ml(中等浓度)、200ng/ml(高浓度)的混合标准工作溶液(其中三氯生浓度为其它成分对应浓度的10倍)各250ml。每种浓度溶液按每份移取40ml的量分别移取6份，并分别置于盛有1.0g(精确至0.1mg)原纸(不含目标化合物的同类型纸张)碎片(约0.5cm
×
0.5cm)的100ml具塞三角瓶中，超声提取30min。静置5min，移取2～3ml萃取液于离心管中，以5000r/min速率离心5min。移取1ml上清液，经0.22μm有机相滤膜过滤，收集滤液；即加标回收试验按所加标准工作溶液的浓度划分为低浓度、中等浓度、高浓度三组，每组设6个平行试验，方案见表4。
[0130]
各滤液处理好后，按实施例1所述步骤s5，所述步骤s6及所述步骤s7进行样品测定和含量计算。根据检测结果计算低、中、高三组浓度加标回收率和相对标准偏差(rsd,％)，计算结果见表4。
[0131]
表4目标化合物加标回收率、相对标准偏差(n＝6)
[0132][0133]
注：a,b,c混合标准工作溶液中三氯生的浓度为其它化合物对应浓度的10倍。
[0134]
由表4可见，尽管由于纸张具有多孔结构，会吸附部分加标成分，从而使加标回收率受到一定影响，但五种卤代目标化合物的回收率在83.35％～96.69％之间，接近100％，说明本方法具有较好的回收率，测定结果较为准确。三个浓度加标回收数据的rsd均低于10％，说明本方法重现性较好。
[0135]
实施例3实际样品的测定
[0136]
在具体实现中，本发明对从市场随机采购的20余种抑菌纸张(包括：抑菌餐巾、抑菌吸油纸、抑菌抽纸)样品中卤卡班、三氯卡班、三氯生、六氯酚和三溴沙仑含量进行测定。随机购买的20余种抑菌纸张样品中，有2种纸张样品检出含三氯生，其含量分别为0.22mg/kg，0.28mg/kg，远低于《化妆品安全技术规范.2015年版》限量监测要求(最大允许浓度为0.3％)。其余抑菌纸张样品均未检出目标化合物。检测结果表明，在一定程度上抑菌纸张区域性使用情况良好。