动物类中药标准汤剂氨基酸特征图谱构建及其中药标准汤剂和中药配方颗粒氨基酸含量检测的制作方法

1.本发明属于动物类中药的质量标准研究领域，具体涉及一种动物类中药标准汤剂氨基酸特征图谱的构建及动物类中药的中药标准汤剂和中药配方颗粒氨基酸含量检测。


背景技术：

2.动物类中药应用历史悠久，在我国药物应用史上具有极其重要的地位。现存最早有关于动物类中药的专著《神农本草经》中收载了麝香、羚羊角等67味动物药，占药物总量的18.36％；2020版《中国药典》也收载了51味动物药，其中含动物药的成方制剂有461味，占成方制剂和单味制剂总量的30.9％。
3.动物药已有的鉴别分析手段针对的是药材，主要通过性状鉴别和显微鉴别来区分，而其标准汤剂以及配方颗粒经过水提取、浓缩制备而来，与药材和饮片相比，已失去固有的形态，在质量控制上缺少性状和显微鉴别所依据的重要指标。土鳖虫、蝉蜕、鸡内金、鳖甲、地龙、僵蚕是常用临床动物药，目前，还没有建立有效的方法来区分土鳖虫、蝉蜕、鸡内金及其炮制品、鳖甲及其炮制品、地龙、僵蚕的标准汤剂或/和配方颗粒。


技术实现要素：

4.基于上述背景技术，本发明的主要目的是提供一种动物类中药标准汤剂氨基酸特征图谱的构建方法，采用该构建方法构建得到的氨基酸特征图谱为参照图谱，能将地龙和僵蚕中的一种以及土鳖虫、蝉蜕、鸡内金及其炮制品、鳖甲及其炮制品的标准汤剂或/和配方颗粒区别开来。
5.本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
6.一种动物类中药标准汤剂氨基酸特征图谱的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：
7.提供含氨基酸对照品的对照品溶液，并取地龙标准汤剂或者僵蚕标准汤剂制备供试品溶液；对所述对照品溶液和所述供试品溶液进行衍生化处理；采用高效液相色谱法对经过衍生化处理的所述对照品溶液和所述供试品溶液进行检测，并将检测所得对照品色谱图和供试品色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，获得氨基酸特征图谱；
8.所述氨基酸对照品包含酪氨酸对照品、蛋氨酸对照品、赖氨酸对照品和精氨酸对照品中的至少一种。
9.在其中一个实施例中，所述氨基酸对照品还包含丝氨酸对照品、甘氨酸对照品、苏氨酸对照品、丙氨酸对照品、脯氨酸对照品、缬氨酸对照品、异亮氨酸对照品、亮氨酸对照品和苯丙氨酸对照品中的至少一种。
10.在其中一个实施例中，所述高效液相色谱法的条件包括：固定相为c18色谱柱；
11.流动相a为体积比为(6.5～7.5):(92.5～93.5)的乙腈和醋酸钠溶液的混合溶液，所述醋酸钠溶液所含醋酸钠的浓度为0.08mol/l～0.12mol/l，流动相b为体积比为(3.5～
4.5):1的乙腈和水的混合溶液，采用梯度洗脱。
12.在其中一个实施例中，梯度洗脱的程序包括：0min～6min，所述流动相a的体积百分比由100％下降至97％；6min～9min，所述流动相a的体积百分比为97％；9min～11min，所述流动相a的体积百分比由97％下降至88％；11min～13min，所述流动相a的体积百分比为88％；13min～18min，所述流动相a的体积百分比由88％下降至80％；18min～29min，所述流动相a的体积百分比由80％下降至72％；29min～33min，所述流动相a的体积百分比由72％下降至66％；33min～36min，所述流动相a的体积百分比由66％下降至0％；36min～39min，所述流动相a的体积百分比为0％。
13.在其中一个实施例中，所述高效液相色谱法的条件还包括：流速为0.8ml/min～1.2ml/min。
14.在其中一个实施例中，所述高效液相色谱法的条件还包括：柱温为38℃～42℃。
15.在其中一个实施例中，所述高效液相色谱法的条件还包括：检测波长为252nm～256nm。
16.在其中一个实施例中，所述高效液相色谱法的条件还包括：进样量为4μl～6μl。
17.在其中一个实施例中，制备所述供试品溶液的步骤包括：对所述地龙标准汤剂或者僵蚕标准汤剂进行蛋白水解，收集水解液，除去所述水解液中的溶剂，所得残渣用溶剂溶解。
18.在其中一个实施例中，蛋白水解采用酸法水解。
19.在其中一个实施例中，所述溶剂采用盐酸的浓度为0.08mol/l～0.12mol/l的盐酸溶液。
20.在其中一个实施例中，所述对照品溶液的溶剂包含盐酸浓度为0.08mol/l～0.12mol/l的盐酸溶液。
21.在其中一个实施例中，衍生化处理采用的衍生化试剂为异硫氰酸苯酯。
22.在其中一个实施例中，所述特征图谱含有酪氨酸、蛋氨酸、赖氨酸和精氨酸的色谱峰。
23.本发明提供如上构建得到的动物类中药标准汤剂氨基酸特征图谱在动物类中药及其中药制剂的鉴别中的应用。
24.在其中一个实施例中，所述动物类中药包含僵蚕、土鳖虫、鸡内金及其炮制品、鳖甲及其炮制品和蝉蜕，或者所述动物类中药包含地龙、土鳖虫、鸡内金及其炮制品、鳖甲及其炮制品和蝉蜕。
25.在其中一个实施例中，所述中药制剂包含中药标准汤剂和中药配方颗粒。
26.一种动物类中药的中药标准汤剂和中药配方颗粒中氨基酸含量的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：
27.提供含氨基酸对照品的对照品溶液，并取待测样品制备供试品溶液；对所述对照品溶液和所述供试品溶液进行衍生化处理；采用高效液相色谱法对经过衍生化处理的所述对照品溶液和所述供试品溶液进行检测，并根据检测所得对照品色谱图和供试品色谱图中的色谱峰的峰面积，确定待测样品中氨基酸的含量；
28.所述动物类中药为土鳖虫、蝉蜕、鸡内金及其炮制品、鳖甲及其炮制品、僵蚕或者地龙。
29.在其中一个实施例中，所述氨基酸对照品包含酪氨酸对照品、蛋氨酸对照品、赖氨酸对照品、精氨酸对照品、丝氨酸对照品、甘氨酸对照品、苏氨酸对照品、丙氨酸对照品、脯氨酸对照品、缬氨酸对照品、异亮氨酸对照品、亮氨酸对照品和苯丙氨酸对照品中的至少一种。
30.在其中一个实施例中，所述高效液相色谱法的条件包括：固定相为c18色谱柱；流动相a为体积比为(6.5～7.5):(92.5～93.5)的乙腈和醋酸钠溶液的混合溶液，所述醋酸钠溶液所含醋酸钠的浓度为0.08mol/l～0.12mol/l，流动相b为体积比为(3.5～4.5):1的乙腈和水的混合溶液，采用梯度洗脱。
31.在其中一个实施例中，梯度洗脱的程序包括：0min～6min，所述流动相a的体积百分比由100％下降至97％；6min～9min，所述流动相a的体积百分比为97％；9min～11min，所述流动相a的体积百分比由97％下降至88％；11min～13min，所述流动相a的体积百分比为88％；13min～18min，所述流动相a的体积百分比由88％下降至80％；18min～29min，所述流动相a的体积百分比由80％下降至72％；29min～33min，所述流动相a的体积百分比由72％下降至66％；33min～36min，所述流动相a的体积百分比由66％下降至0％；36min～39min，所述流动相a的体积百分比为0％。
32.在其中一个实施例中，所述高效液相色谱法的条件还包括：流速为0.8ml/min～1.2ml/min。
33.在其中一个实施例中，所述高效液相色谱法的条件还包括：柱温为38℃～42℃。
34.在其中一个实施例中，所述高效液相色谱法的条件还包括：检测波长为252nm～256nm。
35.在其中一个实施例中，所述高效液相色谱法的条件还包括：进样量为4μl～6μl。
36.在其中一个实施例中，制备供试品溶液的步骤包括：对所述待测样品进行蛋白水解，收集水解液，除去所述水解液中的溶剂，所得残渣用溶剂溶解。
37.在其中一个实施例中，蛋白水解采用酸法水解。
38.在其中一个实施例中，所述溶剂采用盐酸的浓度为0.08mol/l～0.12mol/l的盐酸溶液。
39.在其中一个实施例中，所述对照品溶液的溶剂包含盐酸浓度为0.08mol/l～0.12mol/l的盐酸溶液。
40.在其中一个实施例中，衍生化处理采用的衍生化试剂为异硫氰酸苯酯。
41.与现有技术相比，本发明具备如下有益效果：
42.本发明选择地龙或者僵蚕的标准汤剂作为供试品，并选择合适种类的氨基酸对照品，进一步配合合适的色谱条件，构建得到氨基酸特征图谱，以该氨基酸特征图谱为参照图谱，通过将其与相同色谱条件下获得地龙或僵蚕、土鳖虫、蝉蜕、鸡内金及其炮制品、鳖甲及其炮制品的标准汤剂或/和配方颗粒的色谱图相比较，可将这些不同动物药标准汤剂或/和配方颗粒区别开来。
附图说明
43.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的
附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
44.图1为土鳖虫标准汤剂专属性图；
45.图2为蝉蜕标准汤剂专属性图；
46.图3为鸡内金标准汤剂专属性图；
47.图4为炒鸡内金标准汤剂专属性图；
48.图5为地龙标准汤剂专属性图；
49.图6为鳖甲标准汤剂专属性图；
50.图7为醋鳖甲标准汤剂专属性图；
51.图8为18批鸡内金标准汤剂氨基酸特征图谱共有峰；
52.图9为17批蝉蜕标准汤剂氨基酸特征图谱共有峰；
53.图10为18批地龙(参环毛蚓)标准汤剂氨基酸特征图谱共有峰；
54.图11为15批鳖甲标准汤剂氨基酸特征图谱共有峰；
55.图12为21批土鳖虫(地鳖)标准汤剂氨基酸特征图谱共有峰；
56.图13为3批僵蚕标准汤剂氨基酸特征图谱共有峰；
57.图14为6种动物药标准汤剂共有峰对照品归属图；
58.a：对照品；b：鸡内金；c：蝉蜕；d：地龙(参环毛蚓)；e：鳖甲；f：土鳖虫(地鳖)；h：僵蚕；峰1：丝氨酸；峰2：甘氨酸；峰3：苏氨酸；峰4：丙氨酸；峰5(s)：脯氨酸；峰6：酪氨酸；峰7：缬氨酸；峰8：蛋氨酸；峰9：异亮氨酸；峰10：亮氨酸；峰11：苯丙氨酸；峰12：赖氨酸；峰13：精氨酸；
59.图15为6种动物药标准汤剂含量测定层次聚类分析图。
具体实施方式
60.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更详细的描述。但是，应当理解，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式或实施例。相反地，提供这些实施方式或实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
61.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式或实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”的可选范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。
62.本发明中，“第一方面”、“第二方面”、等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。
63.本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
64.本发明中，涉及到数值区间，如无特别说明，则包括数值区间的两个端点。
65.本发明中涉及的百分比含量，如无特别说明，对于固液混合和固相
‑
固相混合均指质量百分比，对于液相
‑
液相混合指体积百分比。
66.本发明中涉及的百分比浓度，如无特别说明，均指终浓度。所述终浓度，指添加成分在添加该成分后的体系中的占比。
67.本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内进行处理。所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。
68.第一方面，本发明提供一种动物类中药标准汤剂氨基酸特征图谱的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：
69.提供含氨基酸对照品的对照品溶液，并取地龙标准汤剂或者僵蚕标准汤剂制备供试品溶液；对所述对照品溶液和所述供试品溶液进行衍生化处理；采用高效液相色谱法对经过衍生化处理的所述对照品溶液和所述供试品溶液进行检测，并将检测所得对照品色谱图和供试品色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，获得氨基酸特征图谱；
70.所述氨基酸对照品包含酪氨酸对照品、蛋氨酸对照品、赖氨酸对照品和精氨酸对照品中的至少一种。
71.本发明中，所述氨基酸对照品包括选用酪氨酸对照品、蛋氨酸对照品、赖氨酸对照品和精氨酸对照品中的一种、两种、三种以及四种的情形。
72.在其中一个实施例中，所述氨基酸对照品还包含丝氨酸对照品、甘氨酸对照品、苏氨酸对照品、丙氨酸对照品、脯氨酸对照品、缬氨酸对照品、异亮氨酸对照品、亮氨酸对照品和苯丙氨酸对照品中的至少一种(包括一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种的情形)。
73.在其中一个实施例中，所述高效液相色谱法的条件包括：
74.固定相为c18色谱柱；
75.流动相a为体积比为(6.5～7.5):(92.5～93.5)的乙腈和醋酸钠溶液的混合溶液，所述醋酸钠溶液所含醋酸钠的浓度为0.08mol/l～0.12mol/l，流动相b为体积比为(3.5～4.5):1的乙腈和水的混合溶液，采用梯度洗脱。本发明构建方法中：c18色谱柱包括但不限于thermo acclaim c18色谱柱(4.6mm
×
250mm，5μm)、phenomenex luna色谱柱(4.6mm
×
250mm，5μm)、kromasil 100
‑
5c18色谱柱(4.6mm
×
250mm，5μm)等；流动相a可以为乙腈
‑
0.08mol/l醋酸钠溶液(6.5：93.5)、乙腈
‑
0.1mol/l醋酸钠溶液(7：93)、乙腈
‑
0.12mol/l醋酸钠溶液(7.5：92.5)；流动相b为乙腈
‑
水(3.5:1)、乙腈
‑
水(4:1)、乙腈
‑
水(4.5:1)。
76.在其中一个实施例中，梯度洗脱的程序包括：0min～6min，所述流动相a的体积百分比由100％下降至97％；6min～9min，所述流动相a的体积百分比为97％；9min～11min，所述流动相a的体积百分比由97％下降至88％；11min～13min，所述流动相a的体积百分比为88％；13min～18min，所述流动相a的体积百分比由88％下降至80％；18min～29min，所述流动相a的体积百分比由80％下降至72％；29min～33min，所述流动相a的体积百分比由72％下降至66％；33min～36min，所述流动相a的体积百分比由66％下降至0％；36min～39min，所述流动相a的体积百分比为0％。
77.在其中一个实施例中，所述高效液相色谱法的条件还包括：流速为0.8ml/min～1.2ml/min(例如可以为0.8ml/min、1ml/min、1.2ml/min)。
78.在其中一个实施例中，所述高效液相色谱法的条件还包括：柱温为38℃～42℃(例如可以为38℃、40℃、42℃)。
79.在其中一个实施例中，所述高效液相色谱法的条件还包括：检测波长为252nm～
256nm(例如可以为250nm、254nm、256nm)。
80.在其中一个实施例中，所述高效液相色谱法的条件还包括：进样量为4μl～6μl(例如可以为4μl、5μl、6μl)。
81.在其中一个实施例中，制备所述供试品溶液的步骤包括：对所述地龙标准汤剂或者僵蚕标准汤剂进行蛋白水解，收集水解液，除去所述水解液中的溶剂，所得残渣用溶剂溶解。
82.在其中一个实施例中，蛋白水解采用酸法水解。
83.在其中一个实施例中，所述溶剂采用盐酸的浓度为0.08mol/l～0.12mol/l的盐酸溶液(例如可以为0.08mol/l、0.1mol/l、0.12mol/l)。
84.在其中一个实施例中，所述对照品溶液的溶剂包含盐酸浓度为0.08mol/l～0.12mol/l的盐酸溶液(例如可以为0.08mol/l、0.1mol/l、0.12mol/l)。
85.在其中一个实施例中，衍生化处理采用的衍生化试剂为异硫氰酸苯酯。
86.在其中一个实施例中，所述特征图谱含有酪氨酸、蛋氨酸、赖氨酸和精氨酸的色谱峰。
87.第二方面，本发明提供如上构建得到的动物类中药标准汤剂氨基酸特征图谱在动物类中药及其中药制剂的鉴别中的应用。
88.在其中一个实施例中，所述动物类中药包含僵蚕和地龙中的一种，以及土鳖虫、鸡内金及其炮制品、鳖甲及其炮制品和蝉蜕中的至少一种。例如可用于将僵蚕、土鳖虫、鸡内金及其炮制品、鳖甲及其炮制品、蝉蜕的标准汤剂区别开来；也可以用于将地龙、土鳖虫、鸡内金及其炮制品、鳖甲及其炮制品、蝉蜕的标准汤剂区别开来；也可以用于这些动物类药的配方颗粒之间的鉴别。
89.在其中一个实施例中，所述中药制剂包含中药标准汤剂和中药配方颗粒。
90.动物类中药中主要含有的成分是蛋白质、氨基酸、核苷酸、油脂等大分子成分，缺少植物药中常见的次级代谢小分子成分，这给动物类中药特征性的定量指标选择带来了一定的困难。
91.土鳖虫、蝉蜕、鸡内金及其炮制品(炒鸡内金)、地龙、鳖甲及其炮制品(醋鳖甲)、僵蚕是现代中医临床常用的动物类中药，然而现行版的《中国药典》中这些动物类中药的质量标准中均没有含量测定项目。现代学者对动物药的定量大多集中于水解氨基酸的测定，传统的测定例如：梁琨等采用柱前衍生化rp
‑
hplc测定了鸡内金中16种氨基酸的含量；何新荣等采用opa为衍生试剂，同时测定了雌性、雄性地鳖中17种氨基酸的含量；廖彭莹等采用邻苯二甲醛(opa)和9
‑
芴甲基氯甲酸酯(fmoc)为柱前衍生化试剂，同时测定了鳖甲生品和制品中18种氨基酸的含量；在2020版《中国药典》一部龟甲胶含量测定项下测定了l
‑
羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸和l
‑
脯氨酸四种氨基酸。
92.就如上提到的土鳖虫、蝉蜕等动物类中药而言，尽管其氨基酸的含量测定技术已经较为成熟，然而，这些含量测定技术主要集中于药材，在药标准汤剂或配方颗粒中的应用还属空白，标准汤剂和配方颗粒的质量控制和质量保证缺乏有效手段。
93.基于此，作为本发明的第三方面，本发明提供一种动物类中药的中药标准汤剂和中药配方颗粒中氨基酸含量的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：
94.提供含氨基酸对照品的对照品溶液，并取待测样品制备供试品溶液；对所述对照
品溶液和所述供试品溶液进行衍生化处理；采用高效液相色谱法对经过衍生化处理的所述对照品溶液和所述供试品溶液进行检测，并根据检测所得对照品色谱图和供试品色谱图中的色谱峰的峰面积，确定待测样品中氨基酸的含量；
95.所述动物类中药为土鳖虫、蝉蜕、鸡内金及其炮制品、鳖甲及其炮制品、僵蚕或者地龙。
96.在其中一个实施例中，所述氨基酸对照品包含酪氨酸对照品、蛋氨酸对照品、赖氨酸对照品、精氨酸对照品、丝氨酸对照品、甘氨酸对照品、苏氨酸对照品、丙氨酸对照品、脯氨酸对照品、缬氨酸对照品、异亮氨酸对照品、亮氨酸对照品和苯丙氨酸对照品中的至少一种(包括一种、两种、三种、
……
十三种的情形)。
97.在其中一个实施例中，所述高效液相色谱法的条件包括：固定相为c18色谱柱；流动相a为体积比为(6.5～7.5):(92.5～93.5)的乙腈和醋酸钠溶液的混合溶液，所述醋酸钠溶液所含醋酸钠的浓度为0.08mol/l～0.12mol/l，流动相b为体积比为(3.5～4.5):1的乙腈和水的混合溶液，采用梯度洗脱。本发明检测方法中：c18色谱柱包括但不限于thermo acclaim c18色谱柱(4.6mm
×
250mm，5μm)、phenomenex luna色谱柱(4.6mm
×
250mm，5μm)、kromasil 100
‑
5c18色谱柱(4.6mm
×
250mm，5μm)等；流动相a可以为乙腈
‑
0.08mol/l醋酸钠溶液(6.5：93.5)、乙腈
‑
0.1mol/l醋酸钠溶液(7：93)、乙腈
‑
0.12mol/l醋酸钠溶液(7.5：92.5)；流动相b为乙腈
‑
水(3.5:1)、乙腈
‑
水(4:1)、乙腈
‑
水(4.5:1)。
98.在其中一个实施例中，梯度洗脱的程序包括：0min～6min，所述流动相a的体积百分比由100％下降至97％；6min～9min，所述流动相a的体积百分比为97％；9min～11min，所述流动相a的体积百分比由97％下降至88％；11min～13min，所述流动相a的体积百分比为88％；13min～18min，所述流动相a的体积百分比由88％下降至80％；18min～29min，所述流动相a的体积百分比由80％下降至72％；29min～33min，所述流动相a的体积百分比由72％下降至66％；33min～36min，所述流动相a的体积百分比由66％下降至0％；36min～39min，所述流动相a的体积百分比为0％。
99.不同动物类中药的氨基酸种类以及含量存在一定的差异，加上动物类中药自身其它成分的影响，能满足一种动物类中药氨基酸含量测定的方法未必能够满足另外一种，故暂无一种氨基酸检测方法能同时应用于多种动物类中药氨基酸测定的报道，更未有同时应用于多种动物类中药标准汤剂/配方颗粒中氨基酸测定的报道。本发明提供的检测方法中，通过色谱条件的优化，使得该方法能同时应用于土鳖虫、蝉蜕、鸡内金、炒鸡内金、地龙、鳖甲、醋鳖甲、僵蚕的标准汤剂和配方颗粒中不同种类氨基酸含量的测定，不仅为这7种动物类中药的标准汤剂和配方颗粒质量控制提供了含量测定的控制手段，大大地节约了质量标准研究过程以及日后样品检验的成本，同时也为其它动物类中药标准汤剂/配方颗粒中氨基酸含量测定方法提供了参考。
100.在其中一个实施例中，所述高效液相色谱法的条件还包括：流速为0.8ml/min～1.2ml/min(例如可以为0.8ml/min、1ml/min、1.2ml/min)。
101.在其中一个实施例中，所述高效液相色谱法的条件还包括：柱温为38℃～42℃(例如可以为38℃、40℃、42℃)。
102.在其中一个实施例中，所述高效液相色谱法的条件还包括：检测波长为252nm～256nm(例如可以为250nm、254nm、256nm)。
103.在其中一个实施例中，所述高效液相色谱法的条件还包括：进样量为4μl～6μl(例如可以为4μl、5μl、6μl)。
104.在其中一个实施例中，制备供试品溶液的步骤包括：对所述待测样品进行蛋白水解，收集水解液，除去所述水解液中的溶剂，所得残渣用溶剂溶解。
105.在其中一个实施例中，蛋白水解采用酸法水解。本发明对酸法水解所采用的酸种类及其酸解条件不做特别限定，例如可以采用6mol/l的盐酸溶液在150℃水解3小时。优选地，本发明的酸法水解在水解管中进行，相对于传统的在安瓿瓶中进行水解(例如2020年版《中国药典》一部收载的龟甲胶、阿胶、鹿角胶氨基酸测定使用安瓿瓶在150℃进行水解，安瓿瓶易爆裂，存在巨大实验安全事故)，更安全。
106.在其中一个实施例中，所述溶剂采用盐酸的浓度为0.08mol/l～0.12mol/l的盐酸溶液(例如可以为0.08mol/l、0.1mol/l、0.12mol/l)。
107.在其中一个实施例中，所述对照品溶液的溶剂包含盐酸浓度为0.08mol/l～0.12mol/l的盐酸溶液(例如可以为0.08mol/l、0.1mol/l、0.12mol/l)。
108.在其中一个实施例中，衍生化处理采用的衍生化试剂为异硫氰酸苯酯。
109.需要说明的是，本发明的鉴别方法所涉步骤没有顺序限制。
110.本发明中，土鳖虫、蝉蜕、鸡内金及其炮制品、地龙、鳖甲及其炮制品、僵蚕或者地龙的标准汤剂的获得的方式包括但不限于如下例举的方式：
111.取土鳖虫/鸡内金/地龙饮片100g，置电陶瓷壶中，加水煎煮两次，第一次煎煮加入8倍量水，浸泡30分钟后，武火(功率500w)煮沸后文火(功率200w)保持微沸30分钟，煎液经350目筛网趁热滤过，滤液迅速用冷水冷却。第二次煎煮加6倍量水，武火(功率500w)煮沸后文火(功率200w)保持微沸25分钟，煎液用350目筛网趁热滤过，滤液迅速用冷水冷却，合并两次煎液。将煎液转移至圆底烧瓶中，采用旋转蒸发仪减压低温浓缩(温度：65℃；真空度：
‑
0.08mpa～
‑
0.1mpa)，转速60转/分钟，浓缩至体积约为100ml；在磁力搅拌下，精密吸取流浸膏2ml均匀分装于10ml西林瓶中，转移至真空冷冻干燥机中冻干，取出，轧铝盖，即得。
112.取蝉蜕饮片100g，置电陶瓷壶中，加水煎煮两次，第一次煎煮加入14倍量水，浸泡30分钟后，武火(功率500w)煮沸后文火(功率200w)保持微沸30分钟，煎液经350目筛网趁热滤过，滤液迅速用冷水冷却。第二次煎煮加12倍量水，武火(功率500w)煮沸后文火(功率200w)保持微沸25分钟，煎液用350目筛网趁热滤过，滤液迅速用冷水冷却，合并两次煎液。将煎液转移至圆底烧瓶中，采用旋转蒸发仪减压低温浓缩(温度：65℃；真空度：
‑
0.08mpa～
‑
0.1mpa)，转速60转/分钟，浓缩至体积约为100ml；在磁力搅拌下，精密吸取流浸膏2ml均匀分装于10ml西林瓶中，转移至真空冷冻干燥机中冻干，取出，轧铝盖，即得。
113.取鳖甲饮片100g，置电陶瓷壶中，加水煎煮两次，第一次煎煮加入8倍量水，浸泡30分钟，武火(500w)煮沸后文火(200w)保持微沸60分钟，煎液经350目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却。第二次加6倍量水，武火(500w)煮沸后文火(200w)保持微沸40分钟，煎液用350目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却，合并两次煎液。将煎液转移至5000ml圆底烧瓶中，采用旋转蒸发仪减压低温浓缩(温度：65℃；真空度：
‑
0.10mpa)至100ml的流浸膏；在磁力搅拌下，分装至10ml棕色西林瓶中，每瓶分装体积为2ml，半加塞，分装完后转移至真空冷冻干燥机中冻干，取出，轧上铝盖，即得。
114.本发明中，土鳖虫、蝉蜕、鸡内金及其炮制品、地龙、鳖甲及其炮制品、僵蚕或者地
龙的配方颗粒可以通过常规方法获得。
115.下述实施例中所述试验方法，如无特别说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特别说明，均可从商业途径获得。
116.实施例1：方法学验证
117.1.仪器、试剂与试药
118.1.1仪器：thermo高效液相色谱仪(u3000，赛默飞世尔科技有限公司)，thermo acclaim c18色谱柱(4.6mm
×
250mm，5μm)，phenomenex luna色谱柱(4.6mm
×
250mm，5μm)，kromasil 100
‑
5c18色谱柱(4.6mm
×
250mm，5μm)，waters高效液相色谱仪(waters arc，沃特世公司)，万分之一天平(me204e，梅特勒
‑
托利多公司)，百万分之一天平(xp26，梅特勒
‑
托利多公司)，超纯水系统(milli
‑
qdirect，默克股份有限公司)。
119.1.2试剂：盐酸(广州化学试剂厂)、无水乙酸钠(西陇科学股份有限公司)、异硫氰酸苯酯(麦克林试剂)均为分析纯；醋酸(天津市科密欧化学试剂有限公司)、乙腈(默克股份有限公司)、三乙胺(天津市科密欧化学试剂有限公司)均为hplc色谱纯，水为超纯水(实验室自制)。
120.1.3试药：甘氨酸(中国食品药品检定研究院，批号：140689
‑
201605，含量：100％)；丙氨酸(中国食品药品检定研究院，批号：140680
‑
201604，含量：100％)；脯氨酸(中国食品药品检定研究院，批号：140677
‑
201808，含量：99.9％)；缬氨酸((中国食品药品检定研究院，批号：140681
‑
201703，含量：99.5％)；苯丙氨酸(中国食品药品检定研究院，批号：140676
‑
201706，含量：100％)。
121.2.检测方法
122.2.1色谱条件
123.选择thermo acclaim c18(4.6mm
×
250mm，5μm)色谱柱；
124.以乙腈
‑
0.1mol/l醋酸钠溶液(用醋酸调节ph值至6.5)(7:93)为流动相a，以乙腈
‑
水(4:1)为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；柱温为40℃；检测波长为254nm；进样量为5μl。
125.表1、梯度洗脱表
[0126][0127]
2.2对照品溶液的制备
[0128]
精密称取甘氨酸对照品、丙氨酸对照品、脯氨酸对照品、苯丙氨酸对照品及缬氨酸对照品适量，分别加0.1mol/l盐酸溶液制成适合浓度的对照品溶液。
[0129]
2.3供试品溶液的制备
[0130]
取标准汤剂适量，研细，取适量，精密称定，置氨基酸水解管中，精密加入6mol/l盐酸溶液10ml，分别置150℃水解3小时，取出，放冷，滤过，滤液移至蒸发皿中，水解管与滤渣再用水10ml分次洗涤，滤过，滤液并入蒸发皿中，蒸干，残渣加0.1mol/l盐酸溶液溶解，转移
至25ml量瓶中，定容至刻度，摇匀，即得。
[0131]
精密量取上述供试品溶液及对照品溶液各5ml，分别置于25ml量瓶中，加0.1mol/l异硫氰酸苯酯(pitc)的乙腈溶液2.5ml，1mol/l三乙胺的乙腈溶液2.5ml，摇匀，室温放置1小时后，加50％乙腈至刻度，摇匀。取10ml，加正己烷10ml，振摇，放置10分钟，取下层溶液，滤过，取续滤液，即得。
[0132]
3.专属性考察
[0133]
分别取土鳖虫、蝉蜕、鸡内金、炒鸡内金、地龙、鳖甲、醋鳖甲的标准汤剂和空白溶剂(即0.1mol/l盐酸溶液)，按照本实施例“2.3”项下供试品溶液制备方法制备成供试品溶液和空白溶剂溶液；再按照本实施例“2.2”项下对照品溶液制备方法制备对照品溶液；精密吸取供试品溶液、对照品溶液和空白溶剂溶液各5μl，注入液相色谱仪，按照本实施例“2.1”项下拟定色谱条件进行分析。
[0134]
结果显示，土鳖虫、蝉蜕、鸡内金、炒鸡内金、地龙、鳖甲、醋鳖甲的标准汤剂供试品色谱在与对应对照品色谱相应的保留时间处有相同的色谱峰，且空白溶剂无干扰，说明该方法专属性良好(见图1至图7)。
[0135]
4.线性考察
[0136]
精密称取甘氨酸对照品、丙氨酸对照品、脯氨酸对照品、苯丙氨酸对照品、缬氨酸对照品适量，分别用0.1mol/l盐酸溶液配制成适宜浓度的线性对照品贮备溶液。
[0137]
再精密量取上述对照品贮备溶液各5ml，分别置于25ml量瓶中，分别加0.1mol/l异硫氰酸苯酯(pitc)的乙腈溶液2.5ml，1mol/l三乙胺的乙腈溶液2.5ml，摇匀，室温放置1小时后，加50％乙腈至刻度，摇匀。转移到分液漏斗中，加正己烷25ml，振摇，放置10分钟，取下层溶液，得衍生后的对照品贮备溶液。
[0138]
精密量取上述衍生后的对照品贮备溶液适量，使用50％乙腈溶液，制成不同浓度的对照品线性溶液。
[0139]
分别精密吸取上述对照品线性溶液，按照本实施例“2.1”项下拟定的色谱条件依次进样5μl，记录色谱峰面积。以峰面积为纵坐标(y)，对照品浓度为横坐标(x)，并绘制标准曲线，结果如下：
[0140]
表2、甘氨酸线性考察结果
[0141][0142]
表3、丙氨酸线性考察结果
[0143][0144]
表4、脯氨酸线性考察结果
[0145][0146]
表5、苯丙氨酸线性考察结果
[0147][0148]
表6、缬氨酸线性考察结果
[0149][0150]
结果显示，甘氨酸的线性回归方程为：y＝0.8827x
–
0.2427，相关系数r＝1.0000，表明在浓度为3.135μg/ml～313.50μg/ml的范围内甘氨酸浓度与峰面积线性关系良好；丙氨酸的线性回归方程为：y＝0.6830x
–
0.1979，相关系数r＝1.0000，表明在浓度为2.099μg/ml～209.94μg/ml的范围内丙氨酸浓度与峰面积线性关系良好；脯氨酸的线性回归方程为：y＝0.6181x+0.2566，相关系数r＝1.0000，表明在浓度为2.758μg/ml～275.80μg/ml的范围内脯氨酸浓度与峰面积线性关系良好；苯丙氨酸的线性回归方程为：y＝0.4512x
–
0.0794，相关系数r＝1.0000，表明在浓度为2.786μg/ml～278.64μg/ml的范围内苯丙氨酸浓度与峰面积线性关系良好；缬氨酸的线性回归方程为：y＝6957.2x
–
35380，相关系数r＝0.9994，表明在浓度为3.692μg/ml～738.409μg/ml的范围内缬氨酸浓度与峰面积线性关系良好。
[0151]
5.稳定性考察
[0152]
取各动物药的标准汤剂适量，按照本实施例“2.3”项下供试品溶液制备方法制备成供试品溶液，按照本实施例“2.1”项下拟定色谱条件，分别在0至24小时内不同时间点进样，进样体积为5μl，记录各氨基酸峰面积，计算峰面积rsd值，结果如下：
[0153]
表7、土鳖虫(地鳖)标准汤剂含量测定稳定性考察结果表
[0154][0155]
表8、蝉蜕标准汤剂含量测定稳定性考察结果表
[0156]
[0157]
表9、鸡内金标准汤剂稳定性考察结果表
[0158][0159]
表10、炒鸡内金标准汤剂含量测定稳定性考察结果表
[0160][0161]
表11、地龙标准汤剂稳定性考察结果表
[0162][0163]
表12、鳖甲标准汤剂含量测定稳定性考察结果表
[0164][0165]
表13、醋鳖甲标准汤剂含量测定稳定性考察结果表
[0166][0167]
结果显示，各供试品溶液中氨基酸的峰面积rsd均小于3.0％，说明供试品溶液在18小时内稳定性良好。
[0168]
6.重复性考察
[0169]
取同一批动物药的标准汤剂适量，精密称定，平行称定6份，按本实施例“2.3”项下供试品溶液制备方法，各制备供试品溶液6份。按本实施例“2.1”项下拟定色谱条件测定，计算各氨基酸的含量及rsd值，结果如下：
[0170]
表14、土鳖虫(地鳖)标准汤剂含量测定重复性考察结果表
[0171][0172]
表15、蝉蜕标准汤剂含量测定重复性考察结果表
[0173][0174][0175]
表16、鸡内金标准汤剂含量测定重复性考察结果表
[0176][0177]
表17、炒鸡内金标准汤剂含量测定重复性考察结果表
[0178][0179]
表18、地龙标准汤剂含量测定重复性考察结果表
[0180][0181]
表19、鳖甲标准汤剂含量测定重复性考察结果表
[0182][0183]
表20、醋鳖甲标准汤剂含量测定重复性考察结果表
[0184][0185]
结果显示，同一批样品重复测定6次，各成分含量rsd均小于3.0％，表明该分析方法的重复性良好。
[0186]
7.中间精密度考察
[0187]
由其他分析人员在不同日期和不同色谱仪下操作，分别取同一批的土鳖虫(地鳖)标准汤剂、蝉蜕标准汤剂、鸡内金标准汤剂、炒鸡内金标准汤剂、地龙标准汤剂、鳖甲标准汤剂和醋鳖甲标准汤剂适量，精密称定，平行称定6份，按本实施例“2.3”项下供试品溶液制备方法，各制备供试品溶液6份。按本实施例“2.1”项下拟定色谱条件测定，计算各氨基酸的含量及rsd值，结果如下：
[0188]
表21、土鳖虫(地鳖)标准汤剂含量测定中间精密度考察结果表
[0189][0190]
表22、蝉蜕标准汤剂含量测定中间精密度考察结果表
[0191][0192]
表23、鸡内金标准汤剂含量测定中间精密度考察结果表
[0193][0194]
表24、炒鸡内金标准汤剂含量测定中间精密度考察结果表
[0195][0196][0197]
表25、地龙标准汤剂含量测定中间精密度考察结果表
[0198][0199]
表26、鳖甲标准汤剂含量测定中间精密度考察结果表
[0200][0201]
表27、醋鳖甲标准汤剂含量测定中间精密度考察结果表
[0202][0203]
结果显示，同一批样品由不同的人员于不同的时间在不同的仪器上操作，重复测定6次，各氨基酸含量的中间精密度rsd限度为<5％。因此，不同分析人员在不同日期和不同色谱仪下操作，该方法的中间精密度良好。
[0204]
8.准确度考察
[0205]
取各动物药的标准汤剂适量(本实施例“2.3”项下供试品溶液制备量的一半)，精密称定，置于氨基酸水解管中，平行3组，每组3份，分别加入适量的氨基酸对照品(按样品称取量含量的50％、100％、150％)，再分别加入6mol/l盐酸溶液，分别置150℃水解3小时，取出，放冷，滤过，滤液移至蒸发皿中，水解管与滤渣再用水10ml分次洗涤，滤过，滤液并入蒸发皿中，蒸干，残渣加0.1mol/l盐酸溶液溶解，转移至25ml量瓶中，定容至刻度，摇匀，即得。
[0206]
精密量取上述供试品溶液5ml置于25ml量瓶中，加0.lmol/l异硫氰酸苯酯(pitc)的乙腈溶液2.5ml，lmol/l三乙胺的乙腈溶液2.5ml，摇匀，室温放置1小时后，加50％乙腈至刻度，摇匀。取10ml，加正己烷10ml，振摇，放置10分钟，取下层溶液，用0.22μm滤膜过滤，取续滤液，即得。按“2.1”项下色谱条件进行测定，分别进样，测定供试品溶液中各氨基酸含量，计算加样回收率。
[0207]
表28、土鳖虫(地鳖)标准汤剂丙氨酸加样回收率考察结果表(n＝9)
[0208][0209]
表29、土鳖虫(地鳖)标准汤剂脯氨酸加样回收率考察结果表(n＝9)
[0210][0211]
表30、土鳖虫(地鳖)标准汤剂苯丙氨酸加样回收率考察结果表(n＝9)
[0212][0213]
表31、蝉蜕标准汤剂甘氨酸加样回收率考察结果表(n＝9)
[0214][0215][0216]
表32、蝉蜕标准汤剂丙氨酸加样回收率考察结果表(n＝9)
[0217][0218]
表33、蝉蜕标准汤剂脯氨酸加样回收率考察结果表(n＝9)
[0219][0220]
表34、蝉蜕标准汤剂苯丙氨酸加样回收率考察结果表(n＝9)
[0221][0222]
表35、鸡内金标准汤剂甘氨酸加样回收率考察结果表(n＝9)
[0223][0224]
表36、鸡内金标准汤剂丙氨酸加样回收率考察结果表(n＝9)
[0225][0226][0227]
表37、鸡内金标准汤剂脯氨酸加样回收率考察结果表(n＝9)
[0228][0229]
表38、鸡内金标准汤剂苯丙氨酸加样回收率考察结果表(n＝9)
[0230][0231]
表39、炒鸡内金标准汤剂甘氨酸加样回收率考察结果表(n＝9)
[0232][0233]
表40、炒鸡内金标准汤剂丙氨酸加样回收率考察结果表(n＝9)
[0234][0235]
表41、炒鸡内金标准汤剂脯氨酸加样回收率考察结果表(n＝9)
[0236][0237][0238]
表43、鳖甲标准汤剂甘氨酸加样回收率考察结果表(n＝9)
[0239]
[0240]
表44、鳖甲标准汤剂脯氨酸加样回收率考察结果表(n＝9)
[0241][0242]
表45、鳖甲标准汤剂缬氨酸加样回收率考察结果表(n＝9)
[0243][0244]
表46、醋鳖甲标准汤剂甘氨酸加样回收率考察结果表(n＝9)
[0245][0246]
表47、醋鳖甲标准汤剂脯氨酸加样回收率考察结果表(n＝9)
[0247][0248]
表48、醋鳖甲标准汤剂缬氨酸加样回收率考察结果表(n＝9)
[0249][0250]
结果显示，所有样品氨基酸的回收率均在92％～105％范围内，表明回收率良好。
[0251]
实施例2：氨基酸特征图谱的建立及共有峰归属
[0252]
1.仪器、试剂与试药
[0253]
1.1仪器：thermo高效液相色谱仪(u3000，赛默飞世尔科技有限公司)，thermo acclaim c18色谱柱(4.6mm
×
250mm，5μm)，phenomenex luna色谱柱(4.6mm
×
250mm，5μm)，kromasil 100
‑
5c18色谱柱(4.6mm
×
250mm，5μm)，waters高效液相色谱仪(waters arc，沃特世公司)，万分之一天平(me204e，梅特勒
‑
托利多公司)，百万分之一天平(xp26，梅特勒
‑
托利多公司)，超纯水系统(milli
‑
qdirect，默克股份有限公司)。
[0254]
1.2试剂：盐酸(广州化学试剂厂)、无水乙酸钠(西陇科学股份有限公司)、异硫氰酸苯酯(麦克林试剂)均为分析纯；醋酸(天津市科密欧化学试剂有限公司)、乙腈(默克股份有限公司)、三乙胺(天津市科密欧化学试剂有限公司)均为hplc色谱纯，水为超纯水(实验室自制)。
[0255]
1.3试药：甘氨酸(中国食品药品检定研究院，批号：140689
‑
201605，含量：100％)；丙氨酸(中国食品药品检定研究院，批号：140680
‑
201604，含量：100％)；脯氨酸(中国食品药品检定研究院，批号：140677
‑
201808，含量：99.9％)；缬氨酸((中国食品药品检定研究院，批号：140681
‑
201703，含量：99.5％)；苯丙氨酸(中国食品药品检定研究院，批号：140676
‑
201706，含量：100％)。苏氨酸(中国食品药品检定研究院，批号：140682
‑
201302，含量99.9％)；酪氨酸(中国食品药品检定研究院，批号：140609
‑
201914，含量：99.9％)；异亮氨酸(中国食品药品检定研究院，批号：140683
‑
201302，含量：99.9％)；苯丙氨酸(中国食品药品检定研究院，批号：140676
‑
201706，含量：100％)；l
‑
赖氨酸(chem faces公司，批号：cfs201902，含量：≥98％)；蛋氨酸(四川省维克奇生物科技有限公司，批号：wkq20061207，含量：≥98％)
[0256]
2.建立方法
[0257]
2.1色谱条件
[0258]
选择thermo acclaim c18(4.6mm
×
250mm，5μm)色谱柱；以乙腈
‑
0.1mol/l醋酸钠溶液(用醋酸调节ph值至6.5)(7:93)为流动相a，以乙腈
‑
水(4:1)为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；柱温为40℃；检测波长为254nm；进样量为5μl。
[0259]
表49、梯度洗脱表
[0260]
分别对鸡内金标准汤剂、蝉蜕标准汤剂、土鳖虫(地鳖)标准汤剂、鳖甲标准汤剂、地龙(参环毛蚓)标准汤剂共89批标准汤剂样品氨基酸特征图谱进行数据处理，采用平均数，时间窗口为0.1，自动匹配，分别以上述5种动物药标准汤剂共有模式作为对照特征图谱，计算相似度系数，同一品种动物药标准汤剂相似度均高于0.95，相似度结果说明同一品种标准汤剂不同批次间的化学成分具有较好的一致性，结果见下表。
[0273]
表51、7种不同品种动物药饮片标准汤剂样品相似度评价结果
[0274][0275]
3.样品氨基酸含量检测应用
[0276]
表52、各品种标准汤剂氨基酸含量比较
[0277]
[0278]
[0279][0280]
层次聚类分析：运用spss 20.0软件对以上92批标准汤剂样品进行聚类分析，采用组间平均数联结，以平方euclidean距离作为样品相似度的距离公式，欧式距离为4时，上述样品聚为六类，其中dl
‑
yc
‑
01～dl
‑
yc
‑
18聚为ⅰ类，为地龙(参环毛蚓)标准汤剂；jnj
‑
t
‑
01～jnj
‑
t
‑
18聚为ⅱ类，为鸡内金标准汤剂；ct
‑
t
‑
01～ct
‑
t
‑
17聚为ⅲ类，为蝉蜕标准汤剂；bj
‑
t
‑
01～bj
‑
t
‑
15聚为ⅳ类，为鳖甲标准汤剂；jc
‑
t
‑
15～jc
‑
t
‑
17聚为
ⅴ
类，为僵蚕标准汤剂；tbc
‑
t
‑
01～tbc
‑
t
‑
21聚为
ⅵ
类，为土鳖虫标准汤剂，见图15。
[0281]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0282]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所述附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。