一种靶向检测啮齿类动物非结合型胆汁酸的方法及其检测试剂盒

：
1.本发明属于生物化学检测领域，以啮齿类动物体内的非结合型胆汁酸为研究对象，开发了一种基于gc-ms靶向分析啮齿类动物中非结合胆汁酸的新方法及其检测试剂盒。


背景技术：

2.胆汁酸(bas)是胆固醇的重要代谢产物。胆汁酸可分为结合型胆汁酸和非结合胆汁酸。近年来，研究发现非结合胆汁酸作为重要的信号分子参与代谢和免疫等调节，并与炎症性肠病、结直肠癌、肝癌等疾病的发生发展密切相关。非结合型bas是法尼醇x受体(farnesoid x receptor,fxr)的内源性配体，而fxr是调节bas合成和转运的关键负反馈调节受体，并且与免疫、能量代谢相关联。因此，在相关研究中非结合胆汁酸指标备受关注，其组成和变化是重要的分析目标。
3.非结合型bas在甾体母核上带有一个戊酸侧链，并在α3、α6、α7和α12位含有1-3个羟基，它们化学性质性质相似，单独依靠色谱仪进行分离和鉴定比较困难，需要使用色谱质谱联用技术。目前bas的检测多采用液相色谱-质谱联用(lc-ms)技术。lc-ms方法对结合型和非结合型bas都可以分析。lc-ms的优点在于，不需要对样品进行衍生化处理，样品前处理简单，但是其谱图可检索性差，鉴定缺乏通用可靠的数据库，需要依赖贵重的标准品。gc-ms不能直接分析结合型bas，但是适合分析非结合型bas。使用gc-ms分析，尽管需要对样品进行衍生化处理，但优势在于谱图的高重现性和可检索性，并拥有通用、可靠和极大容量的数据库，方便代谢物的鉴定分析。另外gc相比lc也具有更高的分离能力和灵敏度。检测生理条件下浓度相对较低的非结合型bas，需要准确和灵敏的检测方法。大鼠和小鼠两种啮齿类动物是疾病研究中重要的模型动物，普遍应用于肠道和肝脏等胆汁酸相关疾病的研究，但是其胆汁酸检测目前存在一些问题，首先gc-ms广泛使用数据库中只含有少数bas的谱图，啮齿类动物特有的α-mca、β-mca、ω-mca未收录在库中，其次，没有研究报道提供gc-ms检测啮齿类动物非结合型bas的方法和试剂盒，这些都制约了gc-ms方法在啮齿类动物bas相关代谢研究中的应用。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于通过确定啮齿类动物体内8种主要非结合胆汁酸的特征离子，建立一种适用于啮齿类动物体内非结合胆汁酸的基于gc-ms靶向分析的检测方法。
5.本发明的另一目的在于提供所述方法的检测试剂盒。
6.本发明的第一方面，确立了啮齿类动物体内8种非结合胆汁酸的特征离子及定量离子。
7.啮齿类动物体内8种非结合胆汁酸的特征离子及定量离子如下所示：
8.在另一优选例中，所述啮齿类动物体内非结合胆汁酸特征离子及定量离子的确定采用gc-ms全扫描(scan)模式进行检测。
9.本发明的第二方面，提供一种适用于啮齿类动物体内非结合胆汁酸的基于gc-ms靶向分析的检测方法及其检测试剂盒。
10.另一优选例中，所述啮齿类动物体内非结合胆汁酸靶向分析检测方法采用gc-ms sim模式进行检测。
11.另一优选例中，所述试剂盒中包括啮齿类动物体内8种非结合胆汁酸混标储备液(a)、内标ca-d4(b)、吡啶(c)、n-甲基-n-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(d)、三甲基氯硅烷(e)、buffer(f)；所述啮齿类动物体内8种非结合胆汁酸混标(a)是将所有1mg/ml非结合胆汁酸(ca、cdca、lca、dca、udca、α-mca、β-mca、ω-mca)储备溶液用80％甲醇稀释，制备成混标储备液，使每种非结合胆汁酸的浓度为100μg/ml。所述内标ca-d4(b)是使用80％甲醇配制为1μg/ml的内标溶液；所述buffer(f)为80％甲醇溶液。
12.另一优选例中，所述试剂盒的检测方法包括如下步骤：
13.(1)标准溶液及生物样品的制备：
14.将8种非结合胆汁酸混标储备液(a)用buffer(f)按梯度稀释成100、50、20、10、2、1、0.5、0.2、0.1μg/ml作为工作标准溶液备用。为制备标准曲线，取每个工作标准溶液50μl与50μl的内标ca-d4(b)混合于ep管中，使混标终浓度为50、25、10、5、1、0.5、0.25、0.1、0.05μg/ml。使用氮气将样品吹干，干燥后的样品低温放置，保持环境干燥，便于后续操作。
15.血清：血清解冻后取300μl加入预冷的buffer(f)600μl，涡旋震荡1min，冰水浴超声提取10min并于4℃，10000g离心10min；取700μl上清液转移到ep管中，加入50μl浓度1μg/ml内标ca-d4(b)。使用氮气将样品吹干，以便后续进行衍生；平行处理三个样品。
16.粪便：取40mg粪便，加入预冷的buffer(f)400μl，珠磨机研磨20s，共3次，冰上超声10min，然后放在4℃静置20min。10000g离心10min，取300μl上清液转移到ep管中，加入50μl 1μg/ml内标ca-d4(b)。使用氮气将样品吹干，以便后续进行衍生；平行处理三个样品。
17.肝脏：称取冷冻组织样本到含有陶瓷珠的破碎管中，每60mg组织，加入预冷的buffer(f)600μl。珠磨机研磨20s，共3次，4℃，冰上超声10min，10000g离心10min，取450μl上清液转移到ep管中，加入预冷的buffer(f)600μl。珠磨机研磨20s，共3次，4℃，冰上超声10min，10000g离心10min，取450μl上清液转移到上述ep管中，共萃取两次，加入50μl浓度为1μg/ml内标ca-d4(b)。使用氮气将样品吹干，以便后续进行衍生；平行处理三个样品。
18.(2)衍生化：在上述干燥的样品(标准溶液及生物样品)中加入50μl吡啶溶液(c)将样品进行复溶，再加入50μl含有1％三甲基氯硅烷(e)的n-甲基-n-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(d)，震荡离心然后60℃金属浴30min以进行衍生化反应，获得tms衍生物。取出样品在冰上静置1min，然后在4℃下，12000rpm离心10min，取上清到气相小瓶。
19.(3)gc-ms sim模式靶向分析。
20.(4)标准曲线的建立：将各种非结合胆汁酸峰面积除以内标峰面积，得到相对峰面积。以非结合胆汁酸浓度(μg/ml)为横坐标，相对峰面积为纵坐标建立8种非结合胆汁酸的标准曲线。
21.(5)生物样品非结合胆汁酸的定量：将生物样品中检测出来的各种非结合胆汁酸峰面积除以内标峰面积，得到相对峰面积。代入到(4)所述标准曲线中进行定量。
附图说明
22.图1scan模式下8种非结合胆汁酸标准品的gc-ms分析。(a)8种非结合胆汁酸标准品的gc-ms叠加色谱图。1:lca,2:α-mca,3:dca,4:cdca,5:ca,6:udca,7:β-mca,8:ω-mca(b)8种非结合胆汁酸的质谱图。图2gc-ms靶向分析非结合bas的重复性和回收率。a)保留时间重复性。b)峰面积重复性。c)回收率
具体实施方式：
23.下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步说明，但本发明不只限于这些实施例，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
24.实施例1：gc-ms靶向分析方法的建立
25.(1)标准溶液的制备：
26.将非结合型胆汁酸ca、cdca、lca、dca、udca、α-mca、β-mca、ω-mca和ca-d4分别用甲醇溶解配制成1mg/ml的单标储备溶液。将8种非结合胆汁酸混标储备液用80％甲醇溶液按梯度稀释成100、50、20、10、2、1、0.5、0.2、0.1μg/ml作为工作标准溶液备用。为制备标准曲线，取每个工作标准溶液50μl与50μl的内标ca-d4混合于ep管中，使混标终浓度为50、25、10、5、1、0.5、0.25、0.1、0.05μg/ml。使用氮气将样品吹干，干燥后的样品低温放置，保持环境干燥，便于后续操作。
27.(2)衍生化：
28.在上述干燥的样品(标准溶液及生物样品)中加入50μl吡啶(c)溶液将样品进行复溶，再加入50μl含有1％三甲基氯硅烷(e)的n-甲基-n-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(d)，震荡离心然后60℃金属浴30min以进行衍生化反应，以获得tms衍生物。取出样品在冰上静置1min，然后在4℃下，12000rpm离心10min，取上清到气相小瓶。
29.(3)gc-ms scan模式分析：
30.gc-ms分析使用agilent 7890b gc(aglient,usa)系统，结合agilent 5977b质量选择检测器(msd)(aglient,usa)进行。将1μl衍生后的样品以不分流模式进样到色谱柱。色谱柱为hp-5ms(60m
×
0.32mm
×
0.25μm)，是(5％-苯基)-甲基聚硅氧烷色谱柱，在280℃下的流速为1ml/min。柱箱温度程序为：60℃维持2分钟，20℃/min升至220℃，维持8分钟，10℃/min升至320℃，保持10分钟。将(1)标准溶液的制备所述各种非结合胆汁酸单标储备液通过
全扫描(scan)模式进行检测，其8种非结合胆汁酸标准品的叠加色谱图及相应质谱图如图1所示。得出的各种非结合胆汁酸的保留时间、特征离子及定量离子如表1所示。
31.表1非结合胆汁酸保留时间、特征离子及定量离子
[0032][0033]
(4)gc-ms sim模式靶向分析：
[0034]
采用电子轰击电离(ei)模式，所有离子均采用选择离子监测(sim)模式进行监测。选择强度或稳定性最高的离子作为定量离子。其色谱条件与实施例1(3)所述相同。对非结合胆汁酸的tms衍生物进行了验证和定量。所有定量计算均基于相对于内标ca-d4的峰面积比。
[0035]
实施例2：gc-ms靶向分析方法及试剂盒性能的验证
[0036]
(1)标准曲线的建立：将各种非结合胆汁酸峰面积除以内标峰面积，得到相对峰面积。以非结合胆汁酸浓度(μg/ml)为横坐标，相对峰面积为纵坐标建立8种非结合胆汁酸的标准曲线。
[0037]
(2)检测限与定量限的确定：检测限(lod)和定量限(loq)分别基于3：1和10：1的信噪比。其中各种非结合胆汁酸的标准方程、lod与loq如表2所示。
[0038]
表2非结合胆汁酸标准方程、保留时间、相关系数(r2)、lod与loq
[0039][0040]
(3)重复性测定：在1天内对小鼠粪便样品进行5次重复分析，测定批间相对标准偏差(％rsd)。由图2(a)可知各种非结合胆汁酸的平行样品出峰时间波动很小，其sd值在0.0028s-0.0098s之间，反映出gc在保留时间上具有极高的精密度。与之相比，lc在色谱保留时间上波动相对较大，需要经常对保留时间进行校准和验证，以免影响定性和定量结果。由图2(b)所示，所有峰面积均使用内标进行校正，非结合胆汁酸相对峰面积的rsd《3％，因
此重现性良好。
[0041]
(4)回收率测定：方法回收率是通过比较每个样品的胆汁酸浓度(a)与同一样品加入已知浓度(c)的胆汁酸标准品时的胆汁酸浓度(b)进行比较。加标前后样品的处理、胆汁酸的提取和衍生化的进行方式均一致。因此，回收率＝(b-a)/c*100％。考察回收率可以反映基质对bas测定的影响以及方法的准确性。回收率的测定结果由图2(c)所示，非结合胆汁酸回收率为72.02％～115％。因此该方法对非结合胆汁酸的定量及试剂盒的性能具有良好的可靠性和重复性。
[0042]
实施例3：靶向分析方法及试剂盒在生物样品测试中的应用
[0043]
(1)生物样品的制备
[0044]
血清：血清解冻后取300μl加入600μl buffer(e)，涡旋震荡1min，冰水浴超声提取10min并于4℃，10000g离心10min；取700μl上清液转移到ep管中，加入50μl浓度为1μg/ml ca-d4。使用氮气将样品吹干，以便后续进行衍生；平行处理三个样品。
[0045]
粪便：取40mg粪便，加入400μl buffer(e)，珠磨机研磨20s，共3次，冰上超声10min，然后放在4℃静置20min。10000g离心10min，取300μl上清液转移到ep管中，加入50μl浓度为1μg/ml内标ca-d4(b)。使用氮气将样品吹干，以便后续进行衍生；平行处理三个样品。
[0046]
肝脏：称取冷冻组织样本到含有陶瓷珠的破碎管中，每60mg组织，加入预冷的萃取液600μl。珠磨机研磨20s，共3次，4℃，冰上超声10min，10000g离心10min，取450μl上清液转移到ep管中，加入预冷的萃取液600μl。珠磨机研磨20s，共3次，4℃，冰上超声10min，10000g离心10min，取450μl上清液转移到上述ep管中，共萃取两次，加入50μl浓度为1μg/ml ca-d4。使用氮气将样品吹干，以便后续进行衍生；平行处理三个样品。
[0047]
(2)衍生化：与实施例1(2)方法一致
[0048]
(3)gc-ms sim模式靶向分析：与实施例1(4)方法一致
[0049]
(4)生物样品非结合胆汁酸的定量：将小鼠体内三种生物样品中检测出来的各种非结合胆汁酸峰面积除以内标峰面积，得到相对峰面积。代入到实施例1所述标准曲线中进行定量。所得结果如表3所示
[0050]
表3小鼠生物样品中非结合胆汁酸含量
[0051]