利用流式细胞仪检测半乳糖苷酶标记的衰老细胞的方法

1.本发明属于细胞检测领域，具体涉及一种利用流式细胞仪检测半乳糖苷酶标记的衰老细胞的方法。


背景技术：

2.衰老是一切生物体所共有的现象。在多细胞生物中，衰老的标志为多种细胞和组织功能的持续下降。衰老的最突出的特征之一是功能的逐渐丧失或退化，这种功能的丧失或退化发生在包括分子、细胞、组织和个体各个水平。在具有可再生组织的生物体中，衰老的另一标志还在于增生水平的提高，其中最为严重的即是癌症的发生。与其他衰老相关的退行性疾病类似，癌症的发病率大约在个体的整个寿命期的中期开始明显增加。越来越多的证据表明，细胞衰老这一压力应答机制与多种衰老相关病症直接或间接相关联。近年的研究结果(baker dj et al.2016naturally occurring p16-positive cellsshortenhealthy life span.nature 530，184
–
189)认为细胞衰老在提高与年龄相关的肿瘤发生率中起到重要的作用，实验结果显示在小鼠体内去除衰老细胞后肿瘤发生的水平显著降低。因此，监测细胞衰老状况对相关疾病的预防和早期治疗具有重要意义。
3.伊桐凝等(高糖诱导人脐静脉内皮细胞衰老过程中活性氧与二甲基精氨酸二甲胺水解酶-非对称性二甲基精氨酸系统的变化，中国危重病急救医学， 2011年5月第23卷第5期)研究了高糖加速内皮细胞衰老过程中细胞内活性氧(ros)水平与二甲基精氨酸二甲胺水解酶一非对称性二甲基精氨酸 (ddah-adma)系统的变化，具体研究方法为：正常糖浓度培养液(5.5mmol/l) 和高糖培养液(11.0、22.0、33.0mmol/l)作用于人脐静脉内皮细胞48h后，用β-半乳糖苷酶染色法在荧光显微镜下观察衰老细胞，聚合酶链反应-酶联免疫吸附法(pcr-elisa)检测端粒酶活性，流式细胞仪检测细胞内ros水平，液质联用仪检测细胞上清液中adma含量及ddah活性。该研究利用显微镜观察，胞质蓝染者为衰老细胞。但是，利用显微镜观察衰老细胞，只能对半乳糖苷酶标记的衰老细胞进行定性分析，无法定量分析。因此，亟需一种能够对衰老细胞进行定量分析的方法。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种利用流式细胞仪定量检测半乳糖苷酶标记的衰老细胞的方法。
5.本发明提供了利用流式细胞仪检测半乳糖苷酶标记的衰老细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
6.(1)检测半乳糖苷酶标记的待检测细胞的平均荧光强度：将半乳糖苷酶与待检测细胞共同孵育后，使用流式细胞仪488nm波长激光激发荧光，用第一通道接收发射荧光信号，得到半乳糖苷酶标记的待检测细胞的平均荧光强度；
7.(2)检测未标记的待检测细胞的平均荧光强度：将未标记的待检测细胞使用流式细胞仪488nm波长激光激发荧光，用第一通道接收发射荧光信号，得到未标记的待检测细胞
的平均荧光强度；
8.(3)以未标记的待检测细胞作为阴性对照，设门，根据步骤(1)和步骤(2)得到的平均荧光强度，计算出步骤(1)待检测细胞中的衰老细胞含量。
9.进一步地，所述衰老细胞是氧化应激剂诱导的衰老细胞。
10.进一步地，所述氧化应激剂为h2o2。
11.进一步地，所述待检测细胞为胚胎成纤维细胞。
12.进一步地，所述半乳糖苷酶为β-半乳糖苷酶。
13.进一步地，所述待检测细胞的密度为(10～50)
×
104个/ml。
14.进一步地，所述共同孵育的时间为5～30分钟。
15.进一步地，所述共同孵育的时间为15分钟。
16.进一步地，所述第一通道的带通滤光片能接收526
±
29nm波长范围的发射荧光。
17.进一步地，所述第一通道的带通滤光片能接收526
±
14.5nm波长范围的发射荧光。
18.本发明提供了一种利用流式细胞仪定量检测半乳糖苷酶标记的衰老细胞的方法，扩展了流式细胞仪的用途，为检测半乳糖苷酶标记的衰老提供了新的方法。
19.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
20.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
[0021][0022]
图1：流式细胞仪分析图。
[0023]
图2：光学显微镜观察图。
具体实施方式
[0024]
本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
[0025]
实施例1、利用流式细胞仪检测半乳糖苷酶标记的衰老细胞的方法
[0026]
一、检测方法
[0027]
1.建立衰老细胞模型
[0028]
a.提前配置好培养基：dmem高糖培养基+10％fbs(胎牛血清)。
[0029]
b.在6孔板中铺种nih3t3细胞(小鼠胚胎成纤维细胞)，每孔10
×
104个细胞，2ml培养基。
[0030]
c.轻轻混匀后放置于37℃，5％co2细胞培养箱培养24小时。分成三组：不加药对照组，低剂量组，高剂量组。
[0031]
d.不加药对照组更换新鲜培养基；低剂量组和高剂量组分别弃掉培养基，用pbs洗涤3次，加入1ml pbs，然后低剂量组加入200mm的h2o2，高剂量组加入400mm的h2o2，处理1小时，吸走处理液，加入新鲜培养基。
[0032]
e.继续培养3天后，衰老细胞模型建立完成。
[0033]
2.β-半乳糖苷酶标记
[0034]
a.把不加药对照组，低剂量组，高剂量组分别各自再分成两组，一组进行贴壁标记，一组进行消化后标记。
[0035]
b.对于贴壁标记色组：6孔板中的贴壁细胞，吸除细胞培养液，用pbs 洗涤1次，加入1mlβ-半乳糖苷酶标记固定液，室温固定15分钟。吸除细胞固定液，用pbs洗涤细胞3次，每次3分钟。吸除pbs，每孔加入 1ml标记工作液。37℃孵育过夜，可以用封板膜或保鲜膜封住6孔板防止蒸发。β-半乳糖苷酶染色试剂盒购于solarbio公司，货号：g1580。
[0036]
然后在光学显微镜下观察。
[0037]
c.对于消化后标记组：离心收集胰酶消化后的细胞至1.5ml离心管内，用pbs洗涤1次，加入1mlβ-半乳糖苷酶标记固定液，室温固定15分钟。固定时可以在摇床上缓慢摇动，以避免细胞结成团块。离心，吸除细胞固定液，用pbs洗涤细胞3次，每次3分钟。离心，吸除pbs，每管加入 0.5-1ml标记工作液。37℃孵育过夜。用pbs洗涤1次，再用pbs重悬细胞沉淀。除已有的不加药对照组外，还需要增设不标记对照组。
[0038]
然后用流式细胞仪检测。流式细胞仪用488nm波长激光激发荧光，用第一通道(526
±
14.5nm)接收发射荧光信号。以不标记对照组作为阴性对照，设门，根据细胞的平均荧光强度，定量计算出低剂量组、高剂量组中半乳糖苷酶标记的衰老细胞阳性百分率。
[0039]
二、检测结果
[0040]
表1流式细胞仪检测荧光素信号的阳性百分率
[0041][0042]
注：mfi(mean fluorescence intensity)表示平均荧光强度。
[0043]
光学显微镜观察结果如图2所示。利用光学显微镜只能定性观察染色结果，无法定量分析衰老细胞数量。
[0044]
流式细胞仪检测结果如表1和图1所示。可以看出，不加药对照组只有少量衰老细胞；与不加药对照组相比，h2o2低剂量组和高剂量组的荧光强度明显增强，且高剂量组的衰老细胞荧光强度最高。
[0045]
上述实验结果表明，本发明提供的方法能够利用流式细胞仪定量检测半乳糖苷酶标记的衰老细胞含量。
[0046]
综上，本发明提供了一种利用流式细胞仪定量检测半乳糖苷酶标记的衰老细胞的方法，扩展了流式细胞仪的用途，为检测半乳糖苷酶标记的衰老提供了新的方法。