一种莱克多巴胺便携式高灵敏免疫分析测定试剂盒及其应用

1.本发明涉及食品安全检测免疫分析技术领域，具体涉及一种莱克多巴胺便携式高灵敏免疫分析测定试剂盒及其应用。


背景技术：

2.农兽药是农业生产不可或缺的重要生产资料,对保障农业及粮食生产与安全发挥着重要作用。化学农兽药在可预见的将来, 仍是农产品质量和安全保障不可或缺的手段。食品中农兽药残留及其安全性评估受到科学研究工作者和公众的广泛关注。但是如果长期不合理使用会带来环境污染，生态破坏以及危害人体健康等问题。因此建立高效快速低成本的的兽药残留检测成为重中之重。莱克多巴胺(ractopamine)是一种人工合成的β-肾上腺受体激动剂，在临床上作为治疗支气管哮喘，充血性心力衰竭和肌肉萎缩症的主要药物，因其具有提高生长速率和减少胴体脂肪的作用，经常被非法添加在动物饲料中。由于莱克多巴胺易在动物体内包括肝脏、肌肉等部位大量蓄积，形成兽药残留，人类过量食用含有莱克多巴胺残留的肉及肉制品就可能引发中毒症状，对公众的健康构成直接威胁。世界各国对莱克多巴胺在养殖业的使用标准不尽相同，美国、日本等莱克多巴胺作为瘦肉精被允许用于畜禽养殖，但在中国、欧盟等该类药物被全面禁止。因此，建立高效快速的莱克多巴胺检测技术，对莱克多巴胺残留的监测及快速诊断具有重要意义。
3.免疫分析方法的作用和地位目前已得到国内外学者的广泛认可，免疫分析方法的研究也是检测方法研究最热门的领域之一。在免疫分析方法领域中，我国在酶联免疫分析方法方面开展了较为深入的研究，包括半抗原合成、抗体制备、标记物偶联、反应体系中各种理化性质对免疫分析方法的影响及半抗原结构与其所制备得到抗体之间的构效关系等方面。近年来，我国学者在荧光免疫分析、化学发光免疫分析、生物传感器、生物条形码和纳米金免疫分析方法方面也开展了较多的研究工作。
4.纳米金免疫分析方法目前已成为检测痕量蛋白质、核酸等各类物质最广泛的分析方法之一，通过与免疫反应相结合建立的纳米金免疫分析方法，将免疫分析方法拓广到各个领域。然而该方法建立至今，传统纳米金免疫分析方法检测灵敏度已变得难以满足要求，为了进一步提高检测灵敏度，使其在免疫分析方法中具有更实质性的进展，近年来发展了聚合酶链式反应（pcr）、杂交链式反应（hcr）、环介导等温扩增技术（lamp）和滚环扩增（rca）等扩增技术。其中滚环扩增（rca）是一种简单，高效，恒温的核酸扩增方法。目前，各类方法的检测灵敏度有待提高。
5.血糖仪不同于其他大型检测设备，有着操作简单无需专业人员，携带方便，检测时间短，成本低，不受地点限制等诸多优势成为理想的现场检测设备，自发明起就以检测血糖为最终目标，经多年发展早已对血糖有很强特异性，限制了其应用范围。由于小分子化合物通常情况下只有一个抗原结合位点，因此纳米金免疫分析方法常规采用的“三明治”结构模式基本不能适用于农兽药或生物毒素等小分子物质的检测。


技术实现要素：

6.针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种莱克多巴胺便携式高灵敏免疫分析测定试剂盒，该试剂盒能够同便携式血糖仪联用，可以特异地定量检测食品中莱克多巴胺含量。该试剂盒通过竞争反应体系进行检测，克服了目前免疫分析方法采用的“三明治”结构模式基本不能适用于莱克多巴胺的检测的缺陷。
7.本发明还提供了一种莱克多巴胺便携式高灵敏检测分析试剂盒的应用。
8.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：本发明提供了一种莱克多巴胺便携式免疫分析测定试剂盒，所述试剂盒包含有：莱克多巴胺标准品、莱克多巴胺磁性纳米探针、莱克多巴胺纳米金纳米探针、ssdna-转化酶结合物。
9.所述莱克多巴胺磁性纳米探针由磁性纳米粒子和莱克多巴胺完全抗原偶联而成；所述莱克多巴胺纳米金纳米探针由抗莱克多巴胺抗体和滚环dna包被纳米金颗粒得到；所述滚环dna由硫醇修饰的单链dna引物和环状dna模板部分互补配对而成。
10.所述ssdna-转化酶结合物由与环状dna模板部分相同的硫醇修饰的单链ssdna与转化酶偶联而成。
11.本发明检测的目标物莱克多巴胺（ractopamine）分子式：c
18h23
no3cl;cas号：97825-25-7。
12.本发明通过改变免疫分析方法的现有反应模式，建立基于小分子竞争反应模式的免疫分析方法。通过将莱克多巴胺与载体蛋白的偶联物包被于磁性纳米粒子表面制备莱克多巴胺磁性纳米探针，并于纳米金探针表面结合兽药抗体和起信号放大作用的滚环dna用以制备莱克多巴胺纳米金探针，利用磁性纳米粒子表面的包被抗原与兽药分子竞争结合纳米金探针表面的抗体建立竞争型免疫化学反应体系。利用磁分离系统分离免疫结合的抗原抗体复合物，采用滚环扩增反应使纳米金纳米探针结合加入的ssdna-转化酶结合物催化蔗糖水解生成葡萄糖，并利用便携式血糖仪快速测定葡萄糖含量，实现对莱克多巴胺兽药的定量检测。
13.该试剂盒的使用效果具有便携、快速、灵敏、特异、稳定等优点。并且，根据本发明的检测系统为开放式操作，简便快速，特别适合广大的质检机构推广使用，为食品安全检测提供一种非常有价值的检测手段。
14.纳米金探针是滚环dna包被纳米金颗粒和抗被检物的抗体，滚环dna中的单链dna引物和纳米金颗粒通过au—s键相连，另1个环状dna模板是为被检物放大信号。每一个纳米金颗粒上标记有很多滚环dna，因而起到双重放大信号的作用，灵敏度较高。
15.在实际操作中，滚环dna的选择为现有技术，只要特异性和灵敏度够好即可。
16.优选的，所述莱克多巴胺完全抗原由莱克多巴胺和载体蛋白偶联而成；所述载体蛋白为牛血清白蛋白（bsa）、酪蛋白（casein）或鸡卵白蛋白（ova）；所述磁性纳米粒子的粒径为18~22nm；所述纳米金颗粒的粒径为13~15nm；所述抗莱克多巴胺抗体为单克隆抗体；所述转化酶为蔗糖酶来源于面包酵母。
17.磁性纳米粒子的粒径对莱克多巴胺完全抗原的偶联数量有着很大的影响，从而影响着最终反应的灵敏度。
18.优选的，如上所述的试剂盒，所述抗莱克多巴胺抗体为单克隆抗体。
19.单克隆抗体由于可以通过细胞株进行生产，各批次之间性质稳定，且特异性强，因而更适合试剂盒产品。
20.本发明的技术要点是通过形成莱克多巴胺磁性纳米探针-莱克多巴胺双标纳米金纳米探针的结合，与莱克多巴胺-莱克多巴胺双标纳米金纳米探针的结合进行竞争，并且前者的结合应该可以均一的分离。灵敏度提高的关键在于被检物的有效回收和作为每个被检物识别结合位点对应的滚环dna的有效滚环扩增（rca反应）放大信号以及ssdna-转化酶的结合实现信号的二次放大。滚环dna的量对应被检物的量（莱克多巴胺磁性纳米探针对被检莱克多巴胺的竞争性结合的抑制率），因此可以通过定量杂交在滚环dna上ssdna-转化酶催化蔗糖水解生成的葡萄糖间接定量痕量的被检物。莱克多巴胺磁性纳米探针-莱克多巴胺纳米金纳米探针的结合实质是磁性纳米探针中的莱克多巴胺完全抗原与纳米金纳米探针中的抗莱克多巴胺抗体的结合，而二者的结合强度与抗体/抗原的量密切相关，抗体/抗原的量则与纳米金颗粒/磁性纳米粒子的粒径密切相关。
21.优选的，所述莱克多巴胺磁性纳米探针具体由以下方法制备得到：a)微球的活化：用ph=6.0，15mmol/l的2-(n-吗啡啉)乙磺酸缓冲液（mes）作为活化缓冲溶液，取1ml磁珠于2.0ml离心管中，加入活化缓冲溶液后，将上清液吸掉；再用活化缓冲液重新洗涤磁珠2遍，再分别加入碳二亚胺与n-羟基琥珀酰亚胺，在漩涡振荡器上混合均匀，室温活化30min；b)微球与bsa-半抗原偶联：用ph=7.4，0.01mol/l的磷酸盐吐温(pbst，1%tween-20)溶液作偶联缓冲液，用活化缓冲液重新洗涤已经活化的磁珠3遍，再用偶联缓冲液洗涤磁珠2遍；然后用偶联缓冲液重悬磁珠，再加入bsa-半抗原，使得磁珠表面活化的羧基与bsa的氨基于37c下反应1h，将bsa-半抗原偶联于磁珠表面，得到免疫磁珠。
22.c)封闭：用偶联缓冲液洗涤偶联后磁珠2遍，加入含有2% bsa的偶联缓冲液封闭磁珠60min。最终得到免疫磁性探针。
23.进一步的，所述莱克多巴胺纳米金纳米探针具体由以下方法制备得到：（1）取纳米金溶液调ph至8.5~9.0后向其中加入莱克多巴胺抗体，搅拌混合，静置30~40min；然后加入硫醇修饰的单链dna引物，静置36~48h；再调整ph至7.3~7.5，加入nacl至浓度0.08~0.12mol/l，8000~11000r/min离心8~12min，弃上清，得到含寡核苷酸引物的纳米金探针；所述硫醇修饰的单链dna引物的序列为：5'-sh-gtttcctttccttgaaacttcctt-3'（2）用牛血清白蛋白浓度为0.8~1.2%的磷酸盐缓冲溶液重悬含寡核苷酸引物的纳米金探针，孵育1~3h；再加入与硫醇修饰的单链dna引物部分互补的环状dna模板链，室温杂交3~5h，8000~11000r/min离心，弃上清，得到所述莱克多巴胺双标纳米金纳米探针所述环状dna模板链的序列为：5'-tgtcttcgccttgtttcctttccttgaaacttcctttcgactaacacc-3'。
24.优选的，所述莱克多巴胺纳米金纳米探针的步骤（1）中，在加入nacl至既定浓度时，在120~180min内分2~4次等量加入，每次间隔40~60min；优选的，在加入nacl至既定浓度时，在140~160min内分3次等量加入，每次间隔50min。
25.加入nacl的过程即dna的老化过程。纳米金和dna都带负电，所以会相互排斥，加入
nacl可以屏蔽掉纳米金表面的一些电荷，减少纳米粒子间的排斥。但过高浓度的nacl会导致盐离子强度过大，易引起dna团聚，所以将其逐步加入，防止瞬间离子强度的过大。
26.优选的，所述dna-转化酶结合物具体由以下方法制备得到：（1）取转化酶与过量sulfo-smcc混合，涡旋5min，室温震荡1h离心超滤8次，得到纯化转化酶；（2）取硫醇修饰的单链ssdna与纯化转化酶室温摇床孵育48h，离心超滤8次，收集结合物并稀释，得到所述dna-转化酶结合物。
27.本发明还提供了一种上述莱克多巴胺便携式免疫分析测定试剂盒与血糖仪进行免疫分析测定中的应用。
28.进一步的，所述免疫分析测定为利用磁分离系统分离免疫结合的抗原抗体复合物，采用滚环扩增反应促使纳米金纳米探针结合加入的ssdna-转化酶结合物催化蔗糖水解生成葡萄糖，并利用便携式血糖仪快速测定葡萄糖含量，实现对莱克多巴胺兽药的定量检测。
29.优选的，所述免疫分析测定的方法具体包括：a）将莱克多巴胺标准品、提取与净化后的待测样品分别与等体积的莱克多巴胺纳米金探针和莱克多巴胺磁性纳米探针混合孵育；b）洗涤孵育得到与各标准品与待测样品对应的产物并添加phi29dna聚合酶和dntp混合物进行滚环扩增（rca反应）放大信号，再添加ssdna-转化酶结合物信号扩增液实现二次放大信号；c）洗涤后添加蔗糖溶液使用便携式血糖仪对溶液进行测定；d）以莱克多巴胺标准品的浓度为横坐标，各浓度所对应的抑制率为纵坐标，建立标准曲线，并根据标准曲线计算各样品中的莱克多巴胺浓度。本发明通过纳米金免疫分析方法与滚环扩增技术相结合，大大提高了检测灵敏度。本发明通过巧妙设计，构建目标物与葡萄糖之间的关系再结合纳米金免疫分析方法与滚环扩增技术，就可利用便携式血糖仪在现场快速高灵敏检测目标物。
30.与现有技术相比，本发明的有益效果为：1）本发明可以特异地定量检测莱克多巴胺含量。具有简便、快速、灵敏、特异、稳定等优点。并且，根据本发明的检测系统为开放式操作，简便快速，特别适合广大的质检机构推广使用，为食品安全检测提供一种非常有价值的检测手段。
31.2）根据本发明的试剂盒，磁性纳米探针中的莱克多巴胺半抗原与检测样品中的莱克多巴胺竞争莱克多巴胺纳米金探针上的莱克多巴胺单抗形成直接竞争体系，因此本法采用的竞争反应体系，即确保检测的灵敏度，也可有效保证检测结果的良好重现性。另外，这种模式还便于操作和生产。
32.3）本发明的试剂盒与便携式血糖仪联用，通过检测滚环dna对应的葡萄糖信号值，灵敏度大大提高，可为食品中莱克多巴胺的检测提供更为灵敏、快速、可靠的依据。
附图说明
33.图1为本发明实施例中以莱克多巴胺标准品的浓度为横坐标，各浓度所对应的抑制率为纵坐标，建立的标准曲线。
具体实施方式
34.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
35.实施例1莱克多巴胺便携式免疫分析测定试剂盒的制备方法s13、莱克多巴胺纳米金探针的制备（1）金纳米颗粒合成方法向硅化好的烧杯中分别加入98ml去离子水，再分别入2ml 50mm氯金酸原液，使氯金酸的浓度为1mm，在磁力搅拌器上1000rpm/min搅拌、250℃加热，液体沸腾后继续煮沸2min；吸取10ml 38.8mm柠檬酸三钠，迅速一次性加入烧杯中，保持搅拌速度和加热温度不变，继续煮沸6min，可发现溶液颜色由无色逐渐变成紫色，再变成酒红色，根据加入柠檬酸三钠还原剂量的不同最终变成不同的颜色，待液体冷却后用去离子水补回原体积，于4℃密闭保存，合成的金纳米颗粒的粒径控制在13~15nm。
36.（2）取5毫升纳米金溶液，用0.1mol/l k2co3调节至ph=9.0；静置15min，加入200μg的莱克多巴胺单克隆抗体，在搅拌下将纳米金和抗体混合，静置30min。然后加入50μl 200 nmol/l硫醇修饰的单链dna引物，10℃静置40h，再以磷酸缓冲液（pbs）调整至ph=7.4，提高nacl浓度，nacl分3次加入，每隔1个小时加入一次，至终浓度0.1mol/l，10000r/min离心10min，即得到含寡核苷酸引物的纳米金。用2.5ml pbs缓冲液重悬含寡核苷酸引物的纳米金，静置10~15分钟，然后再加入5%牛血清白蛋白(bsa)，使bsa终浓度为1%，封闭1h。再加入与硫醇修饰的所述单链dna链互补的环状dna模板链50μl 200 nmol/l，室温杂交4h，10000r/min离心得到双标纳米金纳米探针。
37.s14、莱克多巴胺磁性纳米探针的制备1）、bsa标记莱克多巴胺半抗原的制备取半抗原0.25mmol, 溶于1ml dmf，搅拌下加入60μl正三丁胺和30μl氯甲酸乙酯，室温搅拌反应1h。取反应液300μl缓慢滴加到6ml溶有120mg bsa 的cbs缓冲溶液（0.01mol/l）中，室温搅拌反应2h后，装入透析袋，先用蒸馏水透析3次，然后用0.01mol/l的pbs透析3d，每天换透析液3-4次。取出分装保存于-20℃的冰箱中。
38.2）、磁性纳米粒子合成方法磁性微球的形成过程：取8.1g fecl3•
6h2o和3.3g fecl2•
4h2o加入150ml去离子水，配成溶液，然后移入三口烧瓶中。在n2保护环境中与剧烈搅拌状态下向fe
2＋
和fe
3＋
的混合溶液中18ml质量分数为25%的浓氨水，溶液中开始生成棕褐色的fe3o4粒子，调节溶液的ph值在9~11之间，此刻反应温度为70℃，在反应的过程中要保证一定的搅拌速度，反应的离子方程式为：fe3o4/油酸的合成：在剧烈搅拌状态下将5.0g油酸（c
18h34
o2）加入fe3o4的液体中，然后在n2保护环境下，温度为70℃水浴中反应一个小时，使油酸均匀的包覆在粒子表面。反应结束后，得到黑色溶胶状物质，利用外加磁场将所得的沉淀从反应体系中分离出来，用乙
醇洗涤3次除去多余的油酸，再用去离子水洗涤至ph=7，此时得到油酸均匀包覆的fe3o4粒子。
39.单层羧基功能化的fe3o4粒子合成：采用高锰酸钾氧化油酸法合成壬二酸(hooc(ch2)7cooh)形成羧基化磁性纳米粒子。加入160ml浓度为10mg/ml 的kmno4溶液在剧烈搅拌状态，温度为50℃条件下反应8h，反应结束后利用外加磁场将所得沉淀从反应介质中分离出来，并先后用去离子水洗涤3次，所得产物在40℃下真空干燥，将干燥后的粒子溶于水溶液便得到稳定的羧基化磁性纳米粒子。磁性纳米粒子的粒径控制在18~22nm。
40.3）、磁性微球和bsa-半抗原的连接a)、微球的活化。用ph=6.0，15mmol/l的2-(n-吗啡啉)乙磺酸缓冲液（mes）作为活化缓冲溶液，取1ml磁珠于2.0ml离心管中，加入活化缓冲溶液后，将上清液吸掉；再用活化缓冲液重新洗涤磁珠2遍，再分别加入 200 μl 15 mmol/l碳二亚胺与n-羟基琥珀酰亚胺，在漩涡振荡器上混合均匀，室温活化30min。
41.b)、微球与bsa-半抗原偶联。用ph=7.4，0.01mol/l的磷酸盐吐温(pbst，1%tween-20)溶液作偶联缓冲液，用500 μl活化缓冲液重新洗涤已经活化的磁珠3遍，再用偶联缓冲液洗涤磁珠2遍；然后用500 μl偶联缓冲液重悬磁珠，再加入100 μg bsa-半抗原偶联物，使得磁珠表面活化的羧基与bsa的氨基于37c下反应1h，将bsa-半抗原偶联于磁珠表面，得到免疫磁珠。
42.c)、封闭。用偶联缓冲液洗涤偶联后磁珠2遍，加入含有2% bsa的偶联缓冲液封闭磁珠60min。最终得到免疫磁性探针。
43.s15、ssdna-转化酶聚合物的制备a)、ssdna的活化。将50μl浓度为100μmol/l的ssdna与1μl pbs和1.5μl浓度为20mmol/l的tcep混合，室温震荡1h，用amicon-3k超滤管14000g离心30min纯化8次；b)、转化酶的活化。将400μl浓度为20mg/ml的转化酶与1mg 4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐，在漩涡振荡器上混合均匀，室温震荡1h，用amicon-100k超滤管14000g离心10min纯化8次；c)、将50μl a)步骤中纯化的ssdna与400 μlb)步骤中纯化激活的转化酶混合，室温孵育48h，用amicon-100k超滤管14000g离心10min纯化8次，用pbs稀释到500μl放在4℃下保存备用。
44.s16、莱克多巴胺标准品的制备用莱克多巴胺纯品配制(10.0 ng l
−1ꢀ‑ꢀ
40
ꢀµ
g l
−1)，共7瓶；所述莱克多巴胺纯品纯度不低于90%；s17、反应体系工作浓度选定经优化选定磁性纳米探针稀释倍数为100倍，纳米金纳米探针稀释倍数为10倍。
45.s18、半成品及成品组成上述步骤所得部分分装即为半成品，抽出三份经过特异性、精密性、灵敏度及稳定性检定合格才能组装为莱克多巴胺便携式免疫分析测定试剂盒，组装成试剂盒后还需抽检合格后才能出厂。
46.综上，在本发明的研究过程中，本发明的发明人首先对所用的原材料进行了筛选试验和质量鉴定，包括抗体和莱克多巴胺半抗原的活性，纳米金颗粒的粒径，磁性纳米颗粒
的粒径和磁性等。然后通过对试剂盒的反应模式、反应时间、偶联效率，等一系列的条件进行了优化，建立了高灵敏度及良好重现性的莱克多巴胺纳米金复合探针结合便携式血糖仪免疫分析测定试剂盒。
47.实施例2本发明的试剂盒使用方法以上实施案例1制备的莱克多巴胺纳米金复合探针结合便携式血糖仪免疫分析测定试剂盒的具体操作如下：s19、自4 ℃冰箱中取出试剂盒，室温平衡10 分钟；s20、反应孔中分别加各浓度莱克多巴胺标准品(10.0 ng l
−1ꢀ‑ꢀ
40
ꢀµ
g l
−1)和经前处理后得到的样品各20 μl，设一个重复，然后每孔加入磁性纳米探针20 μl，用微量振荡器充分振荡混匀，然后置于温度为37℃，相对湿度为70%的恒温恒湿培养箱中温育1 h.；s23、用pbst液洗涤三次，添加0.5μl (units/μl)phi29dna聚合酶和0.5μl(10mmol/l) dntp混合物；s24、添加1μlssdna-转化酶聚合物孵育1h，洗涤后加入200μl(0.5mol/l)蔗糖溶液s25、用便携式血糖仪进行测定；s26、以莱克多巴胺标准品的浓度为横坐标，各浓度所对应的抑制率为纵坐标，建立标准曲线，并根据标准曲线计算各样品中的莱克多巴胺浓度，如图1所示。
48.实验例3本发明试剂盒的方法学检定结果按照本领域中常见的检定规程对实施案例1中制备的试剂盒进行鉴定，结果见表1。
[0049] 表1 本发明试剂盒的方法学检定结果以上结果表明“莱克多巴胺纳米金探针结合便携式血糖仪免疫分析测定试剂盒”的准确性、特异性、精密性、灵敏度和稳定性是完全符合条件的。
[0050]
实验例4莱克多巴胺添加回收率试验为了检验莱克多巴胺纳米金复合探针结合便携式血糖仪免疫分析测定试剂盒的
实际应用性能，我们将莱克多巴胺标准溶液加入到肉样中来模拟被莱克多巴胺的猪肉样品，通过标准添加回收实验来测定猪肉样品中莱克多巴胺的浓度，添加浓度为0.1ng/ml、0.5ng/ml和1.0ng/ml的莱克多巴胺，检测结果见表2。
[0051]
表2 样品中莱克多巴胺的添加回收率最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。