抗角蛋白抗体的免疫球蛋白g的检测方法
技术领域
1.本发明涉及生物体外诊断检测方法，尤其涉及一种抗角蛋白抗体的免疫球蛋白g的检测方法。
背景技术：
2.抗角蛋白抗体(aka)可在类风湿关节炎(ra)病程早期甚至未表现临床症状前出现。高滴度aka与ra的关节侵蚀密切相关，aka可以在ra出现临床表现前检测到，通过分析aka与临床表现、血液学改变、rf、血沉(esr)、c蛋白反应(crp)、其他自身抗体的检出、hla2dr4以及影像学改变的相关性，发现aka与ra患者的关节痛、晨僵及crp有关。还与ra疾病严重程度和活动性相关，在ra早期甚至临床症状出现之前即可出现。因此，它是ra早期诊断和预后判断的指标之一。
3.类风湿性关节炎是一种致残性疾病，发病两年即可出现不可逆的骨关节破坏。现行的美国风湿病学会(acr)诊断标准主要依靠临床表现、x线以及类风湿因子(rf)检测。符合此标准时病人常已出现骨关节破坏，加之rf缺乏特异性，不利于早期诊断、早期干预治疗，因此，根据临床用于ra早期诊断的实验室指标的需要而设计本发明。
技术实现要素：
4.本发明的主要目的是为了提供一种抗角蛋白抗体的免疫球蛋白g检测方法，适用于抗角蛋白抗体的检测，并用于ra提供早期特异的诊断指标，对疾病的判断及预后具有良好的提示作用。
5.本发明的目的是由以下技术方案实现的。
6.本发明的抗角蛋白抗体的免疫球蛋白g的检测方法，其包括以下步骤：
7.第一步：将含有抗角蛋白抗体病人样本加入到角蛋白抗原片的大鼠食管组织反应区上，与抗原片反应区上的大鼠食管组织进行一次反应，待该病人样本中的特异性的角蛋白抗体与抗原片上的大鼠食管组织结合后，用洗涤液洗涤去除抗原片上没有结合的物质；
8.第二步，在完成第一步反应的抗原片反应区再加入异硫氰酸荧光素标记的羊抗人免疫球蛋白g(igg)溶液进行二次反应，产生免疫复合物；该免疫复合物为角蛋白-特异性的抗角蛋白抗体-异硫氰酸荧光素标记的羊抗人免疫球蛋白g(igg)，用洗涤液洗涤去除未进行该次反应的物质；
9.第三步，在进行第一次和第二次反应后的抗原片反应区加入封片剂，然后盖上盖玻片，在荧光显微镜下观察结果，观察到食管角质层有明显荧光，表现为多条连续的板层状或者非连续的点片状的抗角蛋白抗体荧光物，完成检测。
10.前述的抗核周因子抗体的免疫球蛋白g(igg)的检测方法，其中，
11.所述角蛋白抗原片是粘附在载玻片上的大鼠食管组织冰冻切片；该大鼠食管组织冰冻切片是采用体积浓度为1至4％多聚甲醛对大鼠食管组织进行组织固定后再在-25℃冰冻切片而成；
12.所述载玻片采用分子量50000的体积浓度为0.1至0.5％的多聚左旋赖氨酸溶液浸泡，浸泡完后在40℃烤干；然后将大鼠食管组织冰冻切片借助固定液固定在载玻片上，自然干燥成型；
13.所述封片剂为0.05mol/l磷酸盐缓冲液加入体积浓度为50至70％丙三醇和1至5％的4',6-二脒基-2-苯基吲哚组成的混合液体；
14.所述异硫氰酸荧光素标记的羊抗人免疫球蛋白g(igg)溶液是在0.05mol/l磷酸盐缓冲液中加入体积浓度为0.01至0.05％异硫氰酸荧光素标记的羊抗人免疫球蛋白g(igg)和5至10％牛血清白蛋白构成；
15.所述第一步中使用的洗涤液为0.02至0.05mol/l磷酸盐缓冲液中加入体积浓度为0.1至0.5％的聚山梨酯混合而成；
16.所述第二步中使用的洗涤液为0.02至0.05mol/l磷酸盐缓冲液中加入体积浓度为0.1至0.5％的聚山梨酯混合而成。
17.前述的抗角蛋白抗体的免疫球蛋白g(igg)的检测方法，其中，所述固定液为含有体积百分比为4
±
1％多聚甲醛的磷酸盐缓冲液，该磷酸盐缓冲液的浓度为0.01mol/l，ph值为7.4。
18.本发明抗角蛋白抗体的免疫球蛋白g(igg)的检测方法的有益效果，具有敏感度高、特异性强、准确性好、成本低、操作简便以及适用性广的优点，可以为类风湿关节炎提供早期特异的诊断指标，并对疾病的判断以及预后都具有良好的提示作用。
具体实施方式
19.对本发明抗角蛋白抗体的免疫球蛋白g(igg)的检测方法的结构特征及所达成的功效有更进一步的了解与认识，用以较佳的实施例详细的说明如下。
20.本发明的抗角蛋白抗体的免疫球蛋白g(igg)的检测方法，其包括以下步骤：
21.第一步：将含有抗角蛋白抗体病人样本加入到角蛋白抗原片的大鼠食管组织反应区上，与抗原片反应区上的大鼠食管组织进行一次反应，待该病人样本中的特异性的角蛋白抗体与抗原片上的大鼠食管组织结合后，用洗涤液洗涤去除抗原片上没有结合的物质；
22.第二步，在完成第一步反应的抗原片反应区再加入异硫氰酸荧光素标记的羊抗人免疫球蛋白g(igg)溶液进行二次反应，产生免疫复合物；该免疫复合物为角蛋白-特异性的抗角蛋白抗体-异硫氰酸荧光素标记的羊抗人免疫球蛋白g(igg)，用洗涤液洗涤去除未进行该次反应的物质；
23.第三步，在进行第一次和第二次反应后的抗原片反应区加入封片剂，然后盖上盖玻片，在荧光显微镜下观察结果，观察到食管角质层有明显荧光，表现为多条连续的板层状或者非连续的点片状的抗角蛋白抗体荧光物，完成检测。
24.本发明的抗角蛋白抗体的免疫球蛋白g(igg)的检测方法，其中，
25.该角蛋白抗原片是粘附在载玻片上的大鼠食管组织冰冻切片；该大鼠食管组织冰冻切片是采用体积浓度为1至4％多聚甲醛对大鼠食管组织进行组织固定后再在-25℃冰冻切片而成；该载玻片采用分子量50000的体积浓度为0.1至0.5％的多聚左旋赖氨酸溶液浸泡，浸泡完后在40℃烤干；然后将大鼠食管组织冰冻切片借助固定液固定在载玻片上，自然干燥成型；该封片剂为0.05mol/l磷酸盐缓冲液加入体积浓度为50至70％丙三醇和1至5％
的4',6-二脒基-2-苯基吲哚组成的混合液体；该异硫氰酸荧光素标记的羊抗人免疫球蛋白g(igg)溶液是在0.05mol/l磷酸盐缓冲液中加入体积浓度为0.01至0.05％异硫氰酸荧光素标记的羊抗人免疫球蛋白g(igg)和5至10％牛血清白蛋白构成；该第一步中使用的洗涤液为0.02至0.05mol/l磷酸盐缓冲液中加入体积浓度为0.1至0.5％的聚山梨酯混合而成；该第二步中使用的洗涤液为0.02至0.05mol/l磷酸盐缓冲液中加入体积浓度为0.1至0.5％的聚山梨酯混合而成。该固定液为含有体积百分比为4
±
1％多聚甲醛的磷酸盐缓冲液，该磷酸盐缓冲液的浓度为0.01mol/l，ph值为7.4。
26.实施例一：
27.1、制备角蛋白抗原片：
28.先在体积浓度为4％多聚甲醛中重组固定大鼠食管组织，再将大鼠食管组织在-25℃下冰冻固定在冷冻切片机的冷冻头上，调节冷冻切片机切片厚度控钮，使切片厚度6μm，；然后在室温下，将载玻片采用分子量50000的体积浓度为0.5％的多聚左旋赖氨酸溶液进行浸泡，浸泡后的载玻片放在40℃烤干；将大鼠食管组织冰冻切片，粘附固定在载玻片上，干燥密封保存。
29.2、制备异硫氰酸荧光素标记的羊抗人免疫球蛋白g(igg)溶液：在0.05mol/l磷酸盐缓冲液中加入体积浓度为0.02％异硫氰酸荧光素标记的羊抗人免疫球蛋白g(igg)和10％牛血清白蛋白。
30.3、制备封片剂：在0.05mol/l磷酸盐缓冲液加入体积浓度为70％丙三醇和5％4',6-二脒基-2-苯基吲哚。
31.4、洗涤液制备：在0.02mol/l磷酸盐缓冲液中加入0.1％聚山梨酯。
32.5、固定液制备：在浓度为0.01mol/l的磷酸盐缓冲液中加入体积百分比为4％的多聚甲醛混合。
33.6、载玻片处理液制备：按照重量份数称取0.5％多聚左旋赖氨酸(分子量50000)。
34.实施例二：
35.用本发明抗角蛋白抗体的免疫球蛋白g(igg)的检测方法检测类风湿关节炎病人的抗角蛋白抗体。
36.1、确定样本血清：类风湿关节炎患者血清180例，所有病例符合美国风湿病协会类风湿关节炎分类诊断标准。健康人血清60例。
37.2、样本血清检测：
38.第一步：将上述血清样本加入到角蛋白抗原片的大鼠食管组织反应区上，与抗原片反应区上的大鼠食管组织进行一次反应，待该病人样本中的特异性的角蛋白抗体与抗原片上的大鼠食管组织结合后，用洗涤液洗涤去除抗原片上没有结合的物质；
39.第二步，在完成第一步反应的抗原片反应区再加入异硫氰酸荧光素标记的羊抗人免疫球蛋白g(igg)溶液进行二次反应，产生免疫复合物；该免疫复合物为角蛋白-特异性的抗角蛋白抗体-异硫氰酸荧光素标记的羊抗人免疫球蛋白g(igg)，用洗涤液洗涤去除未进行该次反应的物质；
40.第三步，在进行第一次和第二次反应后的抗原片反应区加入封片剂，然后盖上盖玻片，在荧光显微镜下观察结果，观察到观察到食管角质层有明显荧光，表现为多条连续的板层状或者非连续的点片状的抗角蛋白抗体荧光物，完成检测。
41.3、检测结果：抗角蛋白抗体主要出现于类风湿病人，其阳性检出率较高。实验表明抗角蛋白抗体的特异性为93.3％，敏感性为78.3％。
42.本实施例中未将进行说明的内容为现有技术，故，不再进行赘述。
43.本发明抗角蛋白抗体的免疫球蛋白g(igg)的检测方法的优点：采用本方法制备抗原片食管组织结构完整，组织没有碎裂、褶皱和卷片，检测过程食管组织保持完整不脱片，荧光显微镜下结构清晰明了。性能指标满足临床使用要求，因此本方法在诊断类风湿性疾病方面有更好的诊断价值。
44.以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。