GFAP和CNTN1在制备用于胶质母细胞瘤早期筛查和早期诊断试剂盒中的应用

gfap和cntn1在制备用于胶质母细胞瘤早期筛查和早期诊断试剂盒中的应用
技术领域
1.本发明属于分子生物学及肿瘤学领域，具体涉及gfap和cntn1在制备用于胶质母细胞瘤早期筛查和早期诊断试剂盒中的应用。


背景技术：

2.脑胶质瘤是一种起源于中枢神经系统神经胶质细胞的肿瘤，是最常见的原发性颅内肿瘤。据国际癌症研究机构报告，2018年将近30万人患脑肿瘤，24.1万人死亡。美国脑肿瘤注册中心数据显示，75％原发恶性脑瘤是脑胶质瘤。脑胶质瘤5年病死率在全身肿瘤中仅次于胰腺癌和肺癌，位列第三。限制预后提高的主要原因是临床就诊早期病例少、早期诊断率低以及晚期病例临床诊治不规范。因此，早期诊断是提高脑胶质瘤病人预后的核心环节，寻找脑胶质瘤早期诊断指标至关重要。
3.多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma，gbm)是脑胶质瘤中的一种具有高侵袭性、高复发性，高度恶性的颅内肿瘤，在原发性恶性中枢神经肿瘤中发病率最高，占46.1％，约为3.20/10万，且男性多于女性，中位生存期仅为12～15个月。
4.脑胶质瘤早期大多发病隐匿，临床症状无特异性，因此其临床诊断目前主要依赖于ct、mri等影像学检查及活体组织病理学检查等手段。然而，ct检查并不能很好的区分脑胶质瘤与其他脑部病变(如炎症、缺血等)，且具有一定的辐射危害；一些新的mri序列如dti、dwi、pwi、mrs等虽然有助于提高诊断水平和判断预后并有助于鉴别肿瘤复发与放射性坏死，但其价格比较昂贵；而最终的确诊仍需通过肿瘤切除术或活检术来明确神经胶质瘤的病理学诊断。2016年who新的中枢神经系统分类标准发布，该版本第一次在常规组织学特征的基础上加入分子分型来对中枢神经系统肿瘤进行划分，这是分子时代中枢神经系统肿瘤诊断的开端，但初步分子分型难以有效指导临床诊疗。
5.近年的研究发现了一系列恶性肿瘤的分子标志物，其中一些已经应用于临床辅助诊断，比如甲胎蛋白已作为肝癌诊断的一项生物学指标、ca125已应用于卵巢癌的普查和筛选，癌胚抗原(cea)己作为早期诊断肠道腺癌特异性标志物。但目前尚无成熟的分子标志物用于脑胶质瘤的筛查和早期诊断。并且组织活检风险大、花费高、患者接受度低。因此，在早期用非侵入性的方法对于脑胶质瘤的早期诊断和预后有重要意义，寻找高效、特异的胶质瘤分子标志物越来越受到国内外的重视。
6.目前，应用gfap和cntn1联合检测脑胶质瘤患者血清中的表达水平，进行脑胶质瘤早期筛查与诊断分析的检测技术尚未见报道。


技术实现要素：

7.本发明提供蛋白质gfap和cntn1在制备用于胶质母细胞瘤早期筛查和早期诊断试剂盒中的应用。
8.本发明还提供一种用于脑胶质瘤早期筛查和诊断的elisa试剂盒，所述试剂盒含
有两种血清蛋白质标志物，分别为gfap和cntn1。
9.其中，上述elisa试剂盒由以下部分组成：(1)96孔酶标板，(2)酶结合物工作液，(3)显色液底物，(4)洗涤液，(5)结合物稀释液，(6)终止液，(7)gfap和cntn1标准蛋白。
10.优选的，所述(7)中的gfap和cntn1标准蛋白为人gfap和cntn1标准蛋白，含有人gfap重组蛋白冻干粉400ng和cntn1标准蛋白冻干粉10ng。
11.优选的，所述(7)中的所述gfap购自abcam，所述cntn1购自novus。
12.本发明还提供使用所述elisa试剂盒早期筛查和早期诊断胶质母细胞瘤的方法，所述方法含有如下步骤：
13.(1)包被：将50ul待检测血清样本或标准品溶液分别加入96孔板，并向每个孔中加入50ul gfap或cntn1抗体，室温下，在平板摇动器上孵育；
14.(2)封闭：密封平板，在室温下，在平板摇动器上孵育；
15.(3)冲洗：将350ul洗涤液加入到每个孔中，停留至少10秒钟，清洗完毕后，翻转孔板，用干净纸巾轻轻拍打，去除多余的液体，可选地重复1-3次；
16.(4)显色：向每个孔中加入100ul tmb显影液，并在平板摇动器上遮光显色，然后向每个孔中加入100ul终止液，并在平板摇动器上摇动平板；
17.(5)标准曲线：根据标准品od值绘制标准曲线，在标准曲线上查出待检样本的含量；
18.(6)数据统计。
19.本发明还提供使用所述elisa试剂盒早期筛查和早期诊断胶质母细胞瘤的方法，所述方法含有如下步骤：
20.(1)包被：将50ul待检测血清样本或标准品溶液分别加入96孔板，并向每个孔中加入50ul gfap或cntn1抗体，室温下，在设定为400转/分的平板摇动器上孵育2小时；
21.(2)封闭：密封平板，在室温下，在设定为400转/分的平板摇动器上孵育1小时；
22.(3)冲洗：将350ul洗涤液加入到每个孔中，停留至少10秒钟。清洗完毕后，翻转孔板，用干净纸巾轻轻拍打，去除多余的液体，重复3次；
23.(4)显色：向每个孔中加入100ul tmb显影液，并在设定为400转/分的平板摇动器上遮光显色10分钟，然后向每个孔中加入100ul终止液，并在平板摇动器上摇动平板1分钟；
24.(5)标准曲线：根据标准品od值(450nm)绘制标准曲线，在标准曲线上查出待检样本的含量；
25.(6)数据统计：所有的统计均使用graphpad prism 8软件包，p《0.05被认为具有统计学意义。
26.本发明是通过以下技术方案实现的。发明人在前期利用正常人与不同级别脑胶质瘤血清和组织样本进行蛋白质组学分析的基础上，发现gfap和cntn1联合检测gbm的特异度和敏感度较高。人类gfap基因定位于17号染色体长臂2区1带上，由9个外显子和8个内含子组成。gfap主要分布于中枢神经系统的星形胶质细胞，参与细胞骨架的构成并维持其张力强度。cntn1蛋白是免疫球蛋白超家族成员之一。它是一种糖基磷脂酰肌醇(gpi)锚定的神经元膜蛋白，可作为细胞粘附分子。可能在发育中的神经系统中轴突连接的形成中发挥作用。通过与cntnap1的关联，参与有髓外周神经中轴突-胶质连接的形成，以及轴突与有髓胶质细胞之间的信号传递。作为notch1的配体参与少突胶质细胞的生成。与tenascin-r(tnr)
的相互作用诱导神经元的排斥和神经突生长的抑制。
27.这两种血清蛋白质对于脑胶质瘤患者，特别是胶质母细胞瘤具有较高的特异度和敏感性。据报道，血清gfap诊断单发gbm的敏感度及特异度分别为76％和100％，与本团队血清gfap单检gbm的数据(特异度及敏感度分别为83.33/95.45)相差不大，而尚未检索到血清cntn1单独用于检测胶质瘤的数据(serum gfap is a diagnostic marker for glioblastoma multiforme，brain.2007dec；130(pt 12):3336-41.doi:10.1093/brain/awm263)。与单个血清蛋白质检测方法相比，二联检有利于提高脑胶质瘤的检出率。目前，应用gfap和cntn1联合检测脑胶质瘤患者血清中的表达水平尚未见报道。
28.本发明通过检测正常人和脑胶质瘤患者血清中gfap和cntn1的表达水平，通过统计学方法分别分析gfap、cntn1、以及两者联合与脑胶质瘤的相关性，发现血清gfap和cntn1是脑胶质瘤一对较好的检测指标，特别是对于胶质母细胞(gbm)的早期筛查和早期诊断。这将会推动我国脑胶质瘤的诊治水平，也为将来对脑胶质瘤的进一步研究提供思路。
29.有益效果
30.本发明取得的积极有益效果：
31.本发明公开了一种非侵入性早期筛查脑胶质瘤的血清蛋白质标志物，尤其是对于胶质母细胞瘤的早期筛查和早期诊断，具有特别重要的作用和临床应用价值。
附图说明
32.图1：正常成人(22例)、较低级别胶质瘤(lower grade glioma，lgg)(21例)、胶质母细胞瘤(gbm)(18例)及其他癌肿(12例)患者血清gfap、cntc1浓度散点图，及lgg、gbm和其他癌肿患者血清cntn1、gfap浓度值分别与正常人血清浓度值两两独立样本t检验结果。作图和统计均由统计学软件graphpad prism 8完成。*p《.05,**p《.01,***p《.001,****p《.0001
33.图2:gfap单检测的normal-gbm、normal-glioma的roc曲线。作图和统计均通过medcalc完成。
34.图3:cntn1单检测的normal-gbm、normal-glioma的roc曲线。作图和统计均通过medcalc完成。
35.图4:cntn1和gfap二联检测的normal-gbm、normal-glioma的曲线。作图和统计均通过medcalc完成。
具体实施方式
36.下面结合具体的实施例对本发明做进一步说明，但并不限制本发明的保护范围。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购(gfap，abcam；cntn1,novus)。
37.一、研究对象
38.39例胶质瘤患者：包括较低级别胶质瘤(lower grade glioma,lgg)(21例)、胶质母细胞瘤(gbm)(18例)；
39.12例其他癌肿的血清样本，由本中心提供，
40.22例正常人血清样本，为同期进行社区体检的健康个体。
41.用于研究的样本为同期收取，采样、分装、保存条件均一致。
42.二、gfap及cntn1的elisa检测试剂盒
43.试剂盒内设有：
44.(1)96孔酶标板
45.(2)酶结合物工作液
46.(3)显色液底物
47.(4)洗涤液
48.(5)结合物稀释液
49.(6)终止液
50.(7)人gfap/cntn1标准蛋白
51.三、检测方法：
52.(1)包被：将50ul血清样本和标准品溶液分别加入96孔板，并向每个孔中加入50ul抗体。室温下，在设定为400转/分的平板摇动器上孵育2小时。
53.(2)封闭：密封平板，在室温下，在设定为400转/分的平板摇动器上孵育1小时。
54.(3)冲洗：用清洗缓冲液清洗每个孔，然后将350ul清洗缓冲液分配到每个孔中，停留至少10秒钟。重复3次。清洗完毕后，翻转孔板，用干净纸巾轻轻拍打，去除多余的液体。
55.(4)显色：向每个孔中加入100ul tmb显影液，并在设定为400转/分的平板摇动器上遮光显色10分钟。然后向每个孔中加入100ul终止液，并在平板摇动器上摇动平板1分钟。
56.(5)标准曲线：根据标准品od值(450nm)绘制标准曲线，在标准曲线上查出待检样本的含量。
57.(6)数据统计：所有的统计均使用graphpad prism 8软件包。p《0.05被认为具有统计学意义。
58.四、结果分析：
59.表1结果显示，脑胶质瘤(glioma)的患者血清中gfap平均浓度(38.55ng/ml)比正常人(normal)血清中平均浓度(12.35ng/ml)高，而且具有显著的统计学意义(p＝0.0129)；cntn1平均浓度(107.20ng/ml)比正常人血清中平均浓度(101.62ng/ml)高，而且具有显著的统计学意义(p＝0.0082)。
60.脑胶质瘤患者分组之后分别与正常人组比较，较低级别脑胶质瘤(lower grade glioma，lgg)患者血清gfap平均浓度(21.77ng/ml)比正常人的平均浓度(12.35ng/ml)升高，但并未出现统计学意义；但胶质母细胞瘤(gbm)患者血清gfap平均浓度(58.13ng/ml)无论与正常人组(12.35ng/ml)还是较低级别胶质瘤(lower grade glioma，lgg)组(21.77ng/ml)相比均明显升高(表1)，并都具有显著的统计学意义(p值分别为《0.0001/0.003)。
61.较低级别脑胶质瘤(lower grade glioma，lgg)血清cntn1平均浓度(104.10ng/ml)比正常人的平均浓度(101.62ng/ml)略高，但并未出现统计学意义；但胶质母细胞瘤(gbm)患者血清cntn1平均浓度(110.80ng/ml)无论与正常人(101.62ng/ml)还是较低级别脑胶质瘤(lower grade glioma，lgg)组(104.10ng/ml)比均有升高，并且均具有显著的统计学意义(p值分别为《0.0001/0.0081)。
62.表1：正常人、脑胶质瘤患者(glioma)及其他癌肿患者血清gfap、cntc1的两两比较的平均值、标准差及其矫正p值。
[0063][0064]
注：1.表格中的mean1
±
sd和mean2
±
sd分别对应于sample中2个样品的测定结果；2.others为其它癌种(包括食管癌、宫颈癌、肺癌及脑转移癌各3例)。
[0065]
表2：两种血清蛋白联合检测结果
[0066][0067]
表2结果显示，gfap/cntn1单一血清蛋白检测脑胶质瘤的特异度分别为86.36/72.73，灵敏度分别为66.67/71.79，二联检的特异度90.91，比两者单一检测有所提高；灵敏度69.23未有提高。而gfap/cntn1单一血清蛋白检测胶质母细胞瘤(gbm)的特异度为95.45/77.27，灵敏度83.33/94.44，二联检的特异度和灵敏度分别为95.45/100，比两者单一检测有所提高。
[0068]
由图1可知，在正常成人(22例)、较低级别胶质瘤(lower grade glioma，lgg)(21例)、胶质母细胞瘤(gbm)(18例)及其他癌肿(12例)患者血清gfap、cntc1浓度散点图，及lgg、gbm和其他癌肿患者血清cntn1、gfap浓度值分别与正常人血清浓度值两两独立样本t检验中，gfap、cntn1血清浓度值在gbm中比正常人显著增高，而其它癌种与正常人血清浓度值相比无统计学差异。
[0069]
由图2、图3、图4可知，应用2种标记物联合检测gbm/glioma患者血清中的蛋白时，
roc曲线下面积升至0.987/0.822，说明使用该elisa试剂盒和检测方法对脑胶质瘤，尤其是gbm的诊断具有较高的判定正确性和诊断价值，进一步证明了该试剂盒可以作为较理想的gbm筛查手段和方法。
[0070]
实验结果证明，gfap和cntn1蛋白的血清中表达水平是脑胶质瘤一个较好的检测指标，特别是对于gbm患者两者联合检测具有早期诊断的价值，发挥了早期预警的作用，有潜在的临床应用价值。