一种外泌体HER2蛋白的磁免疫化学发光检测试剂盒的制作方法

一种外泌体her2蛋白的磁免疫化学发光检测试剂盒
技术领域
1.本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种外泌体her2蛋白的磁免疫化学发光检测试剂盒。


背景技术：

2.外泌体(exosome)是一种30
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150nm大小、极低密度的细胞外纳米级囊状结构，由细胞经过“内吞
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融合
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外排”等一系列调控过程而形成。外泌体在被发现后的很长一段时间内都没有引起研究者的注意，直到纳米分析技术的引进，以及2013年诺贝尔生物医学奖的公布，这个直径只有几十纳米的颗粒受到了前所未有的重视。外泌体中含有的内容物如dna、rna、蛋白质和信号复合物在受体细胞基因和蛋白表达调控中有重要作用。
3.人类表皮生长因子受体2（her2）是一种由erbb2基因编码的蛋白质，参与导致细胞生长和分化的信号传导途径。her2基因是影响乳腺癌预后的一个重要因素，15%
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20%乳腺癌患者肿瘤过度表达her2，这类的肿瘤生长速度较快且生物行为较为恶性，使得手术后复发率高于其他类型的乳腺癌，而且对部分化学治疗药物也容易有抗药性，造成病患比较差的预后。近年来随着曲妥珠单抗、帕妥珠单抗等乳腺癌抗her2治疗分子靶向药物的不断出现，her2阳性乳腺癌患者的预后进一步得到提高。her2检测结果的判读标准、检测的技术路线、内外部质量控制等，对提高我国乳腺癌her2检测的标准化水平起到了积极推动作用，随着her2靶向药的临床研究进展，也发现her2的检测中存在一些问题。
4.目前采用免疫组织化学法（ihc）检测her2蛋白表达水平，应用原位杂交（ish）法检测her2基因扩增。
5.1）免疫组织化学法：指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项技术。流程为：通过石蜡包埋等方式进行组织固定、蛋白水解等方法进行抗原修复、组织中内源性酶和抗体的封闭、特异性抗体结合检测目标、通过显微镜观察样本。免疫组织化学法检测的缺陷是：1、需要组织样本，且需要进行样本固定等操作处理，存在取样困难，样本处理复杂缺点。2、没有绝对特异的抗体，特异性比较低。3、操作流程比较复杂、不适用自动化。
6.2）原位杂交：是核酸杂交技术的一种方式。其使用标记的互补dna，rna或修饰的核酸链（即探针）定位组织的一部分或部分中的特定dna或rna序列。流程为：玻片准备和样本固定、样品处理是把核酸暴露、探针选择、原位杂交、显微镜检测。原位杂交检测的缺陷是：1、需要组织样本，且需要进行样本固定等操作处理，存在取样困难，样本处理复杂缺点。2、rna单链检测容易受rna酶污染。3、特异性较低。4、杂交程度不能达到100%，特别是在应用较短的cdna探针时，检测效率明显下降。5、操作流程比较复杂、不适用自动化。
7.3）有研究报道过类似的双抗夹心法检测外泌体her2蛋白的方法（所使用的抗体：anti
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her
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2 antibody，r＆d systems，cat no. af1129），该方法采用的外泌体捕获方法为生物素
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亲和素结合，存在无法实现自动化的缺点；信号检测采用差分脉冲伏安法，存在灵敏度低的缺点。


技术实现要素：

8.本发明的目的是，提供一种外泌体表面her2蛋白的磁免疫化学发光检测试剂盒。主要解决现有技术中外泌体her2蛋白检测程序复杂、特异性低的缺点。
9.本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：一种外泌体表面her2蛋白的磁免疫化学发光检测试剂盒，包括：磁珠悬液、her2抗体反应液、洗涤液、发光激发液；所述磁珠悬液中的磁珠微球包被有外泌体抗体；所述her2抗体反应液包括her2抗体、二抗抗体、化学发光标记物，其中化学发光标记物与二抗抗体偶联，her2抗体上的多个抗原表位与二抗抗体进行特异性结合。
10.作为优选实施方案，所述磁珠微球包被的外泌体抗体为cd9、cd63和cd81中的一种或多种，所述外泌体抗体在磁珠悬液中的浓度为0.01～1ug/ml。
11.作为优选实施方案，所述磁珠悬液包括：0.1～30mg/ml的磁珠微球；1
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100mm的tris；0.1
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1.0m的nacl；0.1
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1.0m蔗糖；质量体积比0.1%
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4%的bsa，ph7.5
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8.5，溶剂为水。所述磁珠微球粒径优选为1～3 μm。
12.作为优选实施方案，所述her2抗体反应液包括：0.01～0.1ug/ml的her2抗体，质量体积比为0.01%
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1.0%的bsa，pbs缓冲液，ph7.0
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8.0。所述pbs缓冲液优选为1xpbs缓冲液。
13.作为优选实施方案，所述her2抗体为鼠抗人源的her2抗体，所述鼠抗人源的her2抗体的浓度为0.05ug/ml。
14.作为优选实施方案，所述her2抗体反应液中的二抗抗体为兔抗鼠或羊抗鼠的二抗抗体，浓度为0.01～0.1ug/ml。
15.作为优选实施方案，所述兔抗鼠或羊抗鼠的二抗抗体的浓度为0.03ug/ml。
16.作为优选实施方案，所述her2抗体反应液中的化学发光标记物为吖啶酯。
17.作为优选实施方案，所述发光激发液包括激发液a和激发液b，所述激发液a包括体积百分比0.01～1%的h2o2和0.1～10 m的hno3，溶剂为水；所述激发液b包括0.1～5 m的naoh和体积浓度为0.01～1%的tween
‑
20，溶剂为水。
18.作为优选实施方案，所述洗涤液包括1～20mm的na2hpo4、0.5～10mm的nah2po4、0.1～2m的nacl和体积浓度为0.01～1%的tween
‑
20，溶剂为水。
19.本发明中涉及的英文缩写注释如下：rna：核糖核酸dna：脱氧核糖核酸cdna：互补dnaher2：人类表皮生长因子受体2ish：原位杂交ihc：免疫组织化学法ae：吖啶酯bsa：牛血清白蛋白与现有技术相比，本发明的有益效果如下：1）本发明的外泌体表面her2蛋白检测试剂盒，实现通过血浆、血清样本进行her2蛋白表达量的检测。通过外泌体进行her2蛋白表达检测，灵敏度高、特异性高。
20.2）本发明抗体反应液中的一个her2抗体可以结合多个二抗抗体，形成磁珠cd系列
抗体
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外泌体her2一抗
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n个二抗ae的结构，多个ae分子能够增强发光强度，显著提高检测灵敏度。
21.3）本发明的检测试剂盒采用免疫磁珠体系，可以实现her2蛋白表达量的自动化操作，实现多样本同时进行检测，这样既灵敏又高效，且节约人力成本和时间成本。
附图说明
22.图1是本发明实施例1中采用磁免疫化学发光法检测的发光值与外泌体浓度的线性关系。
具体实施方式
23.下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。
24.实施例1 检测试剂盒中her2抗体一抗和二抗的筛选（1）将血浆、血清样本（血浆、血清样本均来自志愿者献血，处理获得）分别取1ml加入离心管中，1ml的pbs做对照。然后加入50μl的磁珠悬液（50mm的tris；0.5m的nacl；0.4m蔗糖；0.5%（w/v）的bsa，ph7.8；抗体为cd63浓度为0.1ug/ml，磁珠浓度为1mg/ml），充分震荡混匀，室温条件下震荡孵育15min；（2）将离心管瞬时离心约5s，置于磁力架上1min，吸弃液体；（3）加入1ml的洗涤液（8mm的na2hpo4、2mm的nah2po4、0.15m的nacl和0.05%（v/v）的tween
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20），充分震荡混匀，瞬时离心约5s，置于磁力架上1min，吸弃液体；（4）重复步骤（3）2次；（5）购买市售的各款her2抗体以及二抗进行组合，加入100μl的各组合her2抗体反应液（1xpbs缓冲液；质量体积比为0.2%的bsa；ph7.2），充分震荡混匀，37℃条件下震荡孵育10min；（6）将离心管瞬时离心约5s，置于磁力架上1min，吸弃液体；（7）加入1ml的洗涤液，充分震荡混匀，瞬时离心约5s，置于磁力架上1min，吸弃液体；（8）重复步骤（7）4次；（9）加入100μl的激发液a（0.1%（v/v）的h2o2和0.4 m的hno3），轻轻混匀后加入100μl的激发液b（0.2 m的naoh和0.1%（v/v）的tween
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20）；（10）430 nm波长检测外泌体her2蛋白的发光值。检测的数据结果见表1。
25.本发明经过对市售的her2抗体以及二抗进行组合筛选，筛选出较优的组为：组2和组4。数据结果表明：鼠抗人来源的一抗效果最好。发明用一抗选用鼠抗人的her2抗体（胞外），位于胞外蛋白区23
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652位置的抗体，发明用的抗体肽段范围22
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121。本发明可用的一抗不局限于22
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121位置，可扩展至整个包外区的23
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652之间，只是经过筛选后，在胞外蛋白区23
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652区域内的鼠抗人抗体效果较好。二抗选用兔抗鼠或者羊抗鼠，二者均有较好的结果。筛选出的抗体组合在相同的样本检测上信号值会提高很多，信号放大效果突出，有利于检测性能的提高。在以下的实施例中采用的一抗为鼠抗人her2抗体，二抗为兔抗鼠或羊抗鼠抗体。
26.实施例2：外泌体表面her2蛋白的磁免疫化学发光检测（1）取高浓度的细胞上清超离外泌体进行2倍的梯度稀释，获得5个浓度（2.4e+9, 1.2e+9, 6.0e+8，3.0e+8, 1.5e+8个囊泡/ml）的外泌体样本。另外准备200μl的pbs作为阴性对照。
27.（2）将每个样本取100μl加入离心管中，然后加入20μl的磁珠悬液（50mm的tris；0.5m的nacl；0.4m蔗糖；0.5%（w/v）的bsa，ph7.8；抗体为cd63浓度为0.1ug/ml，磁珠浓度为1mg/ml。），充分震荡混匀，37℃条件下震荡孵育15min；（3）将离心管瞬时离心约5s，置于磁力架上1min，吸弃液体；（4）加入1ml的洗涤液（8mm的na2hpo4、2mm的nah2po4、0.15m的nacl和0.05%（v/v）的tween
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20），充分震荡混匀，瞬时离心约5s，置于磁力架上1min，吸弃液体；（5）重复步骤（4）2次；（6）加入100μl的her2抗体反应液（1xpbs缓冲液；质量体积比为0.2%的bsa；ph：7.2），充分震荡混匀，37℃条件下震荡孵育10min。将离心管瞬时离心约5s，置于磁力架上1min，吸弃液体；（7）加入1ml的洗涤液，充分震荡混匀，瞬时离心约5s，置于磁力架上1min，吸弃液体；（8）重复步骤（7）4次；（9）加入100μl的激发液a（0.1%（v/v）的h2o2和0.4 m的hno3），轻轻混匀后加入100μl的激发液b（0.2 m的naoh和0.1%（v/v）的tween
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20）；
（10）430 nm波长检测每个样本的发光值。检测的数据结果见表2。图1为采用磁免疫化学发光法检测的发光值与外泌体浓度的线性关系，横坐标上的1对应外泌体的浓度是1.5e+8。
28.实施例3：血浆/血清来源的外泌体表面her2蛋白检测（1）将血浆、血清样本（血浆、血清样本均来自志愿者献血，处理获得）分别取1ml加入离心管中，1ml的pbs做对照。然后加入50μl的磁珠悬液（50mm的tris；0.5m的nacl；0.4m蔗糖；0.5%（w/v）的bsa，ph7.8；抗体为cd63浓度为0.1ug/ml，磁珠浓度为1mg/ml），充分震荡混匀，室温条件下震荡孵育15min；（2）将离心管瞬时离心约5s，置于磁力架上1min，吸弃液体；（3）加入1ml的洗涤液（8mm的na2hpo4、2mm的nah2po4、0.15m的nacl和0.05%（v/v）的tween
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20），充分震荡混匀，瞬时离心约5s，置于磁力架上1min，吸弃液体；（4）重复步骤（3）2次；（5）加入100μl的her2抗体反应液（1xpbs缓冲液；质量体积比为0.2%的bsa；ph7.2），充分震荡混匀，37℃条件下震荡孵育10min；（6）将离心管瞬时离心约5s，置于磁力架上1min，吸弃液体；（7）加入1ml的洗涤液，充分震荡混匀，瞬时离心约5s，置于磁力架上1min，吸弃液体；（8）重复步骤（7）4次；（9）加入100μl的激发液a（0.1%（v/v）的h2o2和0.4 m的hno3），轻轻混匀后加入100μl的激发液b（0.2 m的naoh和0.1%（v/v）的tween
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20）；（10）430 nm波长检测外泌体her2蛋白的发光值。检测的数据结果见表3。
29.实施例4：外泌体表面her2蛋白的磁免疫化学发光检测检测灵敏度测试（1）取高浓度的细胞上清超离外泌体进行10倍的梯度稀释，获得7个浓度（5.0e+11, 5.0e+10, 5.0e+9，5.0e+8, 5.0e+7，5.0e+6，5.0e+5个囊泡/ml）的外泌体样本。另外准备200μl的pbs作为阴性对照。
30.（2）将每个样本取100μl加入离心管中，然后加入20μl的磁珠悬液（50mm的tris；0.5m的nacl；0.4m蔗糖；0.5%（质量体积比）的bsa，ph7.8；抗体为cd63浓度为0.1ug/ml，磁珠浓度为1mg/ml），充分震荡混匀，37℃条件下震荡孵育15min；（3）将离心管瞬时离心约5s，置于磁力架上1min，吸弃液体；（4）加入1ml的洗涤液（8mm的na2hpo4、2mm的nah2po4、0.15m的nacl和0.05%（v/v）的tween
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20），充分震荡混匀，瞬时离心约5s，置于磁力架上1min，吸弃液体；（5）重复步骤（4）2次；（6）加入100μl的her2抗体反应液（1xpbs缓冲液；0.2%（质量体积比）的bsa；ph：7.2），充分震荡混匀，37℃条件下震荡孵育10min。将离心管瞬时离心约5s，置于磁力架上1min，吸弃液体；（7）加入1ml的洗涤液，充分震荡混匀，瞬时离心约5s，置于磁力架上1min，吸弃液体；（8）重复步骤（7）4次；（9）加入100μl的激发液a（0.1%（v/v）的h2o2和0.4 m的hno3），轻轻混匀后加入100μl的激发液b（0.2 m的naoh和0.1%（v/v）的tween
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20）；（10）430 nm波长检测每各样本的发光值。检测的数据结果见表4。数据结果表明：本发明试剂盒的检测上限为5.0e+11个外泌体/ml的高浓度样本，人1ml血浆内大概有e+10个外泌体，所以本发明试剂盒可以达到临床上的检测上限要求。本发明试剂盒的检测下限为5.0e+7个外泌体/ml，低于该浓度的样本超出检测下限。
31.实施例5：本发明与现有外泌体蛋白检测技术比较现有外泌体检测技术：(1)样品孵育：标有吖啶酯的抗体、标有磁珠抗体与样品孵育，孵育时间为30分钟；(2)磁吸分离：利用吸液装置或移液枪将上述共孵育混合物，以上
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下来回吸取方式，将靶标复合物(磁珠抗体
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外泌体
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吖啶脂抗体)高效捕获于磁珠表面；(3)洗涤：加入清洗液清洗，去除非特异性靶标；(4)释放检测：撤掉外加磁场，利用预激发液过氧化氢释放靶标复合物。之后加入激发液氢氧化钠进行检测。利用化学发光检测仪器检测发光值。
32.本发明方法：（1）样本与磁珠悬液37℃震荡孵育15min；
（2）采用磁分离方式进行清洗3次，去除多余的非外泌体杂质；（3）加入her2一抗
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n个二抗吖啶酯的复合物，与磁珠
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外泌体复合物进行孵育，37℃，10min；（4）采用磁分离方式进行清洗5次，去除多余的杂质；（5）加入激发液a和激发液b，430nm波长检测发光值。
33.对比实验中采用相同的样本，相同的her2检测抗体以及相同的cd63吸附抗体。磁分离和洗涤步骤均采用相同的试剂。检测样本及结果如表5和表6。分离和洗涤步骤均采用相同的试剂。检测样本及结果如表5和表6。
34.本发明方法相对于已有的相似技术在试剂的检测灵敏度上明显提升，检测灵敏度提高一个数量级。同时检测上限也比现有技术提高很多。
35.上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。