检测牡荆素的方法

1.本发明属于医药检测技术领域，具体涉及检测牡荆素的方法。


背景技术：

2.绿豆大曲是以绿豆为主的复方提取液制成的养生酒，具有潜在的保肝功效。绿豆保肝作用的主要生理活性成分是黄酮类成分，牡荆素是绿豆黄酮的主要成分，占比达到98％，文献报道牡荆素在绿豆粉末中检测含量为1.04～1.71mg/g。
3.目前，已经针对绿豆大曲建立了对功效成分添加进行质量控制的指标限值，确定了牡荆素为功效成分质量标志物。常规的高效液相色谱-紫外检测器方法需要经过色谱分离，完成整套分析流程一般需要1小时以上，不适合用于检测样品数量少但对检测效率有较高要求的生产过程的质量控制场景。
4.因此建立一种适用于生产过程的质量控制，简便快速，灵敏度和线性范围均符合绿豆大曲中牡荆素的定量测定的方法是需要解决的技术问题。


技术实现要素：

5.针对现有技术中检测绿豆大曲中牡荆素时间长，灵敏度低且不能定量分析的问题，本发明提供了检测牡荆素的方法，该方法包括以下步骤：
6.(1)合成ncpds：以超支化聚乙烯亚胺和l-苏氨酸为原料，通过水热法制备ncpds，ncpds为非共轭聚合物点；
7.(2)标准曲线绘制：配置不同浓度的牡荆素标准溶液，测定各浓度溶液的荧光强度，以牡荆素浓度为横坐标，f0/f为纵坐标绘制标准曲线；其中f0表示不加牡荆素标准溶液的ncpds荧光强度，f表示加入一定浓度的牡荆素标准溶液后的ncpds荧光强度；
8.(3)荧光测定：测定未添加样品溶液的ncpds溶液荧光强度f0和加入样品溶液的ncpds溶液荧光强度f，将f0/f代入标准曲线中定量分析。
9.其中，步骤(1)中，所述超支化聚乙烯亚胺分子量为mw＝22000～28000da。
10.其中，步骤(1)中，所述ncpds是将超支化聚乙烯亚胺溶于pbs溶液中，搅拌均匀后，加入l-苏氨酸后进行水热反应，反应后冷却，然后透析纯化、冷冻干燥后，即得。
11.其中，步骤(1)中，所述超支化聚乙烯亚胺和l-苏氨酸的质量比为1：5～8。
12.优选地，所述超支化聚乙烯亚胺和l-苏氨酸的质量比为1：6。
13.其中，步骤(1)中，所述水热反应中，反应温度为120～180℃，反应时间为5～8h。
14.优选地，所述水热反应中，反应温度为150℃，反应时间为6h。
15.其中，步骤(1)中，所述水热反应环境为密闭高压条件，压力为0.01～0.05mpa。
16.其中，步骤(1)中，所述透析的分子量截止为3500da，纯化时间为1～2天。
17.其中，步骤(2)中，所述牡荆素标准溶液浓度为0～40μg/ml。
18.其中，步骤(3)中，所述ncpds加入量为1.80～1.99ml，样品溶液加入量为10～200μl。
19.优选地，所述ncpds加入量为1.99ml，样品溶液加入量为10μl。
20.上述检测牡荆素的方法适用于绿豆大曲中牡荆素的定量测定。
21.有益效果：本发明检测方法检测样品用量少，微升级别的样品量即可完成一次测定；本发明检测方法无需样品前处理，是实现快速测定的基础。本发明具备荧光光谱仪的条件下可实现准确定量，若无荧光光谱仪亦可通过紫外光照射下产生的荧光与标准溶液系列的荧光强度作目视比较实现半定量，应用方式灵活。
22.而且本发明方法灵敏，在牡荆素浓度0.05～40μg/ml范围内呈线性关系，回归系数大于0.99。线性范围适合绿豆大曲样品的直接测定，而且检测过程不使用有毒有害试剂，安全性高，适用于生产现场快速检测场景的应用。
附图说明
23.图1为ncpds合成技术示意图；
24.图2为透射电子显微镜下的ncpds图像；
25.图3为ncpds在可见光(左)和波长为365nm的紫外(右)照射下的照片；
26.图4为ncpds对牡荆素的荧光响应线性图。
具体实施方式
27.本发明通过合成对牡荆素有荧光敏感性的非共轭聚合物点(ncpds)，基于自主合成新的荧光材料建立一种适用于绿豆大曲中牡荆素快速测定的荧光定量检测方法。该方法包括以下步骤：
28.(1)合成ncpds：以超支化聚乙烯亚胺和l-苏氨酸为原料，通过水热法制备ncpds，ncpds为非共轭聚合物点；
29.其中，所述超支化聚乙烯亚胺分子量为mw＝22000～28000da。
30.其中，所述ncpds是将超支化聚乙烯亚胺溶于pbs溶液中，搅拌均匀后，加入l-苏氨酸后进行水热反应，反应后冷却，然后透析纯化、冷冻干燥后，即得。
31.其中，所述超支化聚乙烯亚胺和l-苏氨酸的质量比为1：5～8。
32.优选地，所述超支化聚乙烯亚胺和l-苏氨酸的质量比为1：6。
33.其中，所述水热反应中，反应温度为120～180℃，反应时间为5～8h。
34.优选地，所述水热反应中，反应温度为150℃，反应时间为6h。
35.其中，所述水热反应环境为密闭高压条件，压力为0.01～0.05mpa。
36.其中，所述透析的分子量截止为3500da，纯化时间为1～2天。
37.常用的荧光探针制备复杂、毒性较高等，不利于应用与推广；本发明通过合成一种新型非共轭聚合物点ncpds，以解决荧光探针现有合成技术复杂、毒性高、不稳定等问题。
38.而且本发明的ncpds材料具有良好光学性、稳定性和抗氧化性。
39.同时，本发明设计的荧光结合材料比较独到，使牡荆素能够快速被检测到，极大地降低了时间成本。
40.(2)标准曲线绘制：配置不同浓度的牡荆素标准溶液，测定各浓度溶液的荧光强度，以牡荆素浓度为横坐标，f0/f为纵坐标绘制标准曲线；其中f0表示不加牡荆素标准溶液的ncpds荧光强度，f表示加入一定浓度的牡荆素标准溶液后的ncpds荧光强度；
41.其中，所述牡荆素标准溶液浓度为0～40μg/ml。
42.(3)荧光测定：测定未添加样品溶液的ncpds溶液荧光强度f0和加入样品溶液的ncpds溶液荧光强度f，将f0/f代入标准曲线中定量分析。
43.其中，牡荆素的荧光定量分析参数为：激发波长(λex)为340nm，发射波长(λem)为360～650nm，扫描速度为240nm/min，pmt电压为700v，响应时间为0.1s，狭缝宽度为5nm。
44.其中，步骤(3)中，所述ncpds加入量为1.80～1.99ml，样品溶液加入量为10～200μl。
45.优选地，所述ncpds加入量为1.99ml，样品溶液加入量为10μl。
46.在绿豆大曲中加入一定浓度的牡荆素标准溶液，回收率90～105％。符合定量要求。
47.下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
48.实施例
49.(1)非共轭聚合物点(ncpds)的合成：
50.以超支化聚乙烯亚胺(pei，h(nhch2ch2)nnh2，mw＝25 000da)和l-苏氨酸为原料，通过水热法制备ncpds。
51.将0.05g pei溶于15ml 0.1m ph 7.0pbs中。搅拌均匀后，迅速将0.3g l-苏氨酸加入溶液中，获得前驱体溶液，然后将前驱液溶液密封在50ml聚四氟乙烯高压釜中，在150℃下加热6h，冷却至室温后，通过透析袋(分子量截止3500da)纯化2天。通过冷冻干燥获得最终产品，4℃保存备用。所合成的ncpds在365nm紫外照射下表现出强烈的蓝绿色荧光。
52.(2)荧光测定：
53.在石英池(1
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1cm)中加入一定浓度的ncpds 1.99ml和样品溶液10μl，分别记录不加样品溶液的荧光强度f0和加入样品溶液的荧光强度f，将f0/f代入标准曲线法定量。
54.其中，牡荆素的荧光定量分析参数为：激发波长(λex)为340nm，发射波长(λem)为360～650nm，扫描速度为240nm/min，pmt电压为700v，响应时间为0.1s，狭缝宽度为5nm。
55.(3)标准曲线配制：以水配置浓度为0～40μg/ml的牡荆素标准溶液，以步骤(2)的方法测定各浓度溶液荧光强度，以牡荆素浓度为横坐标，f0/f为纵坐标绘制标准曲线。其中f0表示不加标准溶液的ncpds荧光强度，f表示加入一定浓度标准溶液后的ncpds荧光强度。
56.(4)取绿豆大曲生产现场中所生产的绿豆大曲10μl，进行步骤(2)所述的荧光测定，然后将f0/f代入标准曲线法定量，测定绿豆大曲中牡荆素浓度为0.03-0.04mg/ml，与绿豆大曲实际检测浓度相近，误差范围＜5％，整个检测过程消耗时间不超过2min，远远短于现有技术中所采用的高效液相色谱-紫外检测器方法测定时间。而且在绿豆大曲中加入一定浓度的牡荆素标准溶液，回收率90～105％，符合定量要求。