一种分离生物基质中游离态和脂质体态艾立布林的方法与流程

1.本发明涉及一种分离生物基质中游离态和脂质体态艾立布林的方法，尤其涉及在临床前和临床实验中，需要定量检测生物体内的游离艾立布林和总艾立布林的研究，属于生物技术领域。


背景技术：

2.艾立布林通过结合vinka生物碱结合域而产生细胞毒性，进而引起球状微管蛋白聚集，导致有丝分裂过程中止及细胞死亡。疗效试验已经证明，艾立布林对许多类型的肿瘤如乳腺癌、尿路上皮肿瘤、前列腺癌及非小细胞肺癌(包括经多次抗微管药物既往治疗的患者)有治疗活性。但是艾立布林的剂量限制性毒性主要是骨髓抑制和嗜中性粒细胞减少，还包括其他的非血液性毒性事件包括疲劳、恶心、脱发。降低艾立布林的毒性，降低给药频率，提高患者顺应性是推动艾立布林研发的一个重要方向。
3.脂质体(liposome)是一种人工膜。在水中磷脂分子亲水头部插入水中，脂质体疏水尾部伸向空气，搅动后形成双层脂分子的球形脂质体，直径25～1000nm不等。脂质体可用于转基因，或制备的药物，利用脂质体可以和细胞膜融合的特点，将药物送入细胞内部。利用脂质体包裹艾立布林即能达到降低毒性的目的，有延长了药物在人体内的半衰期，从而有效降低了给药的频率。
4.利用脂质体给药，游离药物是其直接发挥药效或毒性的成分，对生物基质中游离成分艾立布林的定量检测能够更加直观的反应药效与药代动力学以及毒性与毒代动力学之间的关系。目前分离游离艾立布林的方法主要是超高速离心法。在355040g的离心力下离心4小时，达到分析游离态艾立布林的目的。此方法对离心机要求非常高，一般实验室不具备条件，样品处理时间特别长，不适合大批量的临床\临床前试验。现在的试验非常需求一种快速、便捷的分离游离态艾立布林的方法。


技术实现要素：

5.本发明的目的旨在提出一种分离生物基质中游离态和脂质体态艾立布林的方法，以满足此生物基质中游离成分艾立布林的定量检测需求，该方法操作简单快速，操作性强。
6.为实现上述目的，本发明提供一种分离生物基质中游离态和脂质体态艾立布林的方法，将生物基质中游离态和脂质体态艾立布林转移至固相萃取柱，经淋洗、洗脱后，使生物基质中游离态和脂质体态艾立布林分离。
7.进一步地，所述固相萃取柱为聚乙烯吡咯烷酮固相萃取柱。
8.进一步地，所述淋洗采用纯水淋洗剂，所述洗脱采用甲醇、异丙醇或乙腈洗脱剂。
9.进一步地，所述纯水淋洗剂的体积为0.8-1.2ml，所述洗脱剂体积为≥0.3ml。
10.进一步地，所述固相萃取柱规格为30mg/1ml、60mg/3ml、150mg/6ml、200mg/6ml和500mg/6ml。
11.进一步地，在上样前和淋洗前分别用不小于0.1ml的血浆平衡固相萃取柱。
12.进一步地，所述生物基质为血浆、血清、全血、排泄物和组织匀浆液中的一种。
13.进一步地，具体包括：首先使用1ml的2-8℃预冷甲醇活化固相萃取柱
→
1ml的2-8℃预冷超纯水活化固相萃取柱
→
0.1ml的2-8℃预冷血浆平衡固相萃取柱环境
→
，转移0.1ml的游离艾立布林和脂质体艾立布林的生物基质样品至固相萃取柱
→
待样品完全被固相萃取柱吸收后，使用0.1ml的2-8℃预冷血浆进行平衡
→
使用0.5ml的2-8℃预冷超纯水淋洗固相萃取柱2次
→
用0.3ml的2-8℃预冷甲醇对固相萃取柱进行2次洗脱，合并收集洗脱液
→
室温条件下氮气吹干洗脱液，并用0.3ml含0.1％fa的20％乙腈进行复溶，转移2μl至液质联用仪定量分析。
14.本发明所达到的有益效果：
15.(1)本方法选择特定的固相萃取柱和合适的淋洗、洗脱试剂。利用固相萃取柱对脂质体和游离艾立布林不同的吸附能力，达到分离游离艾立布林和脂质体艾立布林的目的。使用本发明，游离态脂质体的回收率能够达到90％以上，基本满足了定量检测的需求。
16.(2)本发明是一种全新的分离游离艾立布林和脂质体艾立布林方法，能够满足艾立布林艾立布林临床前/临床试验中药代动力学和毒代动力学的研究需要，满足指导原则的规定。本发明不仅适用于血浆和全血，还适用于排泄物和组织匀浆液等多种生物基质。
17.(3)本方法相较于现有的其它分离方法，试验耗材和仪器易于获得，操作简单、安全，能够批量化操作，满足大批量检测需求。
附图说明
18.图1是实施例5中的标准曲线准确度。
具体实施方式
19.下面结合实施例对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
20.本发明中所采用的试剂和仪器均为市场上常见，均可从市场上购得。
21.实施例1
22.首先使用1ml的2-8℃预冷甲醇活化固相萃取柱
→
1ml的2-8℃预冷超纯水活化固相萃取柱
→
0.1ml的2-8℃预冷血浆改善固相萃取柱环境
→
转移0.1ml的含有1.0μl/ml游离艾立布林生物基质样品至固相萃取柱
→
待样品完全被固相萃取柱吸收后，使用0.1ml的2-8℃预冷血浆对样品进行初淋洗
→
使用0.5ml的2-8℃预冷超纯水淋洗固相萃取柱2次
→
用0.3ml的2-8℃预冷乙腈对固相萃取柱进行洗脱4次，分别收集洗脱液
→
室温条件下氮气吹干4份洗脱液，并分别用0.3ml含0.1％fa的20％乙腈进行复溶，转移2μl至液质联用仪定量分析。
23.重复上述步骤，样品浓度改为2.0μl/ml。结果见表1。
24.实施例2
25.在实施例1的基础上洗脱试剂由异丙醇替代乙腈。结果见表1。
26.实施例3
27.在实施例1的基础上洗脱试剂由甲醇替代乙腈。结果见表1。
28.表1不同洗脱剂的洗脱效率
[0029][0030]
通过对比表1不同洗脱剂的结果，当样品浓度是1μg/ml时，2次洗脱后，3种洗脱剂均能洗脱80％以上，但是当样品浓度变为2μg/ml时，乙腈的洗脱效果明显下降，2次只洗脱36％，异丙醇和甲醇2次的洗脱比例依然能达到80％以上，且洗脱比例不随样品的浓度变换而变化。故甲醇和异丙醇均可以作为本发明的洗脱剂。进一步的考虑到，甲醇的2次洗脱率能到达95％以上，所以选择甲醇为本发明的首选洗脱剂。
[0031]
实施例4
[0032]
首先使用1ml的2-8℃预冷甲醇活化固相萃取柱
→
1ml的2-8℃预冷超纯水活化固相萃取柱
→
0.1ml的2-8℃预冷血浆改善固相萃取柱环境
→
转移0.1ml含有0.75mg/ml脂质体艾立布林的制剂至固相萃取柱
→
待样品完全被固相萃取柱吸收后，使用0.1ml的2-8℃预冷血浆对样品进行初淋洗
→
用0.5ml的2-8℃预冷超纯水淋洗固相萃取柱2次
→
使用0.3ml的2-8℃预冷甲醇对固相萃取柱进行洗脱2次，洗脱液合并收集
→
室温条件下氮气吹干洗脱液，并用0.3ml含0.1％fa的20％乙腈进行复溶，转移2μl至液质联用仪定量分析。平行重复3次。结果见表2。
[0033]
同时取0.1ml含有0.75mg/ml脂质体艾立布林的制剂至ep管，加入0.2ml乙腈，剧烈涡旋5分钟使脂质体破乳。转移10μl至装有990μl含0.1％fa的20％乙腈的ep管中，混匀后转移2μl至液质联用仪定量分析。平行重复3次。结果见表2。
[0034]
表2固相萃取法的选择性
[0035][0036]
表2结果表明，利用本发明分离艾立布林脂质体制剂，检测游离结果，只有总量的0.30％，远低于药典要求(20％)，故本发明的选择性完全满足检测的需求。
[0037]
实施例5
[0038]
根据药典9012通则要求，配制作为标准曲线样品，作为质控样品，采用本专利方法，采集精密度和准确度数数据。精密度和准确度结果见表3，标准曲线准确度结果见图1。
[0039]
表3密度和准确度结果
[0040][0041]
表3和图1的结果表明本方法结果的精密度和准确度满足药典9012通则的要求。
[0042]
实施例6
[0043]
选取2只beagle犬静脉注射艾立布林脂质体，给药后即刻、5min、15min、30min、2h、6h、10h和24h采血。全血离心后分装两份，一份2-8℃保存，用于检测血浆中游离的艾立布林，另外一份-60℃保存，用于检测总的艾立布林。检测结果见表4。
[0044]
表4beagle犬血浆中游离艾立布林和总艾立布林浓度
[0045][0046]
表4结果符合艾立布林脂质体给药后，动物体内总艾立布林和游离艾立布林的代谢趋势，本方法满足试验的需求。
[0047]
综上实施例4-6结果，本发明能够满足艾立布林脂质体临床前和临床试验中对游离艾立布林定量检测的新需求。
[0048]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。