一种区分前列腺炎和前列腺癌的生物标志物及诊断试剂盒的制作方法

1.本发明涉及医学检验技术领域，特别是涉及一种区分前列腺癌和前列腺炎的生物标志物及诊断试剂盒。


背景技术：

2.前列腺癌(prostate cancer,pca)列男性恶性肿瘤发病率的第6位，发病率随着年龄的增长而增长，55岁后逐渐升高，高峰年龄是70～80岁。前列腺癌是一种进程非常缓慢的癌症，在疾病的早期阶段不容易察觉，而一旦前列腺癌开始快速生长或扩散，则病情就会比较严重。早期(肿瘤仅位于前列腺包膜以内)前列腺癌患者可以通过根治性手术或者根治性放疗等方式，达到良好的治疗效果，甚至得以治愈。因此，早诊早治对于前列腺癌患者来说很重要。
3.早期前列腺癌症状并不明显，随着前列腺腺体逐渐增大压迫尿道可引起进行性排尿困难、尿频、尿急、夜尿增多等症状。然而，这些早期症状与另一常见男性前列腺疾病前列腺炎症状相似，但是目前临床常用的诊断方法，包括直肠指诊、血清psa、经直肠前列腺超声等又难以将两种疾病进行区分。
4.生物标志物是指可以标记系统、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能的改变或可能发生的改变的生化指标，检查一种疾病特异性的生物标志物，可用于辅助疾病的鉴定、早期诊断及预防。因此，找到区分前列腺炎和前列腺癌患者的特异性生物标志物，可以有效辅助鉴别两种疾病。


技术实现要素：

5.基于此，本发明的目的在于，提供一种有效区分前列腺炎和前列腺癌的生物标志物及诊断试剂盒，所述生物标志物在前列腺炎和前列腺癌患者血清中存在差异表达，可将两种疾病进行区分，具有灵敏度高、特异性好和准确性较高等优点。
6.具体技术方案为：
7.一种区分前列腺炎和前列腺癌的试剂盒，其包含定量检测生物标志物的试剂，所述生物标志物选自柠檬酸、l-焦谷氨酸、dl-3-苯基乳酸、乙基丙二酸、3-羟基-3-甲基谷氨酸、马尿酸中的至少一种。
8.在其中一些实施例中，所述试剂适用于超高效液相色谱-串联质谱检测技术。
9.在其中一些实施例中，所述试剂的检测样品为血清。
10.在其中一些实施例中，所述试剂盒还包含针对所述生物标志物的标准品。
11.在其中一些实施例中，所述试剂盒还包含样品前处理试剂，所述样品前处理试剂为含0.1～0.3w/v％甲酸的25～35v/v％甲醇水溶液。
12.在其中一些实施例中，所述样品前处理试剂为含0.1w/v％甲酸的30v/v％甲醇水溶液。
13.本发明还提供了生物标志物在制备区分前列腺炎和前列腺癌的试剂中的应用，所
述生物标志物选自柠檬酸、l-焦谷氨酸、dl-3-苯基乳酸、乙基丙二酸、3-羟基-3-甲基谷氨酸、马尿酸中的至少一种。
14.本发明还提供了定量检测生物标志物在样品中含量的试剂在制备区分前列腺炎和前列腺癌试剂盒中的应用，所述生物标志物选自柠檬酸、l-焦谷氨酸、dl-3-苯基乳酸、乙基丙二酸、3-羟基-3-甲基谷氨酸、马尿酸中的至少一种。
15.在其中一些实施例中，所述生物标志物为柠檬酸。
16.在其中一些实施例中，所述生物标志物为l-焦谷氨酸。
17.在其中一些实施例中，所述生物标志物为dl-3-苯基乳酸。
18.本发明通过同时研究前列腺炎和前列腺癌患者静脉血中有机酸代谢物的水平，筛选出了能有效区分前列腺炎和前列腺癌的生物标志物，所述生物标志物选自柠檬酸、l-焦谷氨酸、dl-3-苯基乳酸、乙基丙二酸、3-羟基-3-甲基谷氨酸和马尿酸中的至少一种。所述生物标志物在前列腺炎和前列腺癌患者体内存在差异表达，且差异具有统计学意义。进一步进行roc曲线分析，结果显示，在用于区分前列腺炎和前列腺癌患者时，柠檬酸的auc为0.926，特异性为82.7％，敏感性为91.9％；l-焦谷氨酸的auc为0.864，特异性为75％，敏感性为83.8％；dl-3-苯基乳酸的auc为0.850，特异性为73.1％，敏感性为91.9％；乙基丙二酸的auc为0.843，特异性为78.8％，敏感性为86.5％；3-羟基-3-甲基谷氨酸的auc为0.817，特异性为73.1％，敏感性为81.1％；马尿酸的auc为0.791，特异性为75％，敏感性为73％。以上结果表明所述生物标志物可作为区分前列腺炎和前列腺癌患者的特异性标志物，准确性较高(auc在0.7～0.9之间)；尤其是柠檬酸，其auc高达0.926，说明诊断准确性高。本发明为鉴别前列腺炎和前列腺癌患者提供了一种新的生物标志物，在用于临床辅助诊断时具有采样方便、检测快速高效等优点。
附图说明
19.图1为前列腺炎和前列腺癌患者血清中柠檬酸含量的统计分析结果和roc曲线图；其中，b代表prostatitis组，d代表pca组。
20.图2为前列腺炎和前列腺癌患者血清中l-焦谷氨酸含量的统计分析结果和roc曲线图；其中，b代表prostatitis组，d代表pca组。
21.图3为前列腺炎和前列腺癌患者血清中dl-3-苯基乳酸含量的统计分析结果和roc曲线图；其中，b代表prostatitis组，d代表pca组。
22.图4为前列腺炎和前列腺癌患者血清中乙基丙二酸含量的统计分析结果和roc曲线图；其中，b代表prostatitis组，d代表pca组。
23.图5为前列腺炎和前列腺癌患者血清中3-羟基-3-甲基谷氨酸含量的统计分析结果和roc曲线图；其中，b代表prostatitis组，d代表pca组。
24.图6为前列腺炎和前列腺癌患者血清中马尿酸含量的统计分析结果和roc曲线图；其中，b代表prostatitis组，d代表pca组。
具体实施方式
25.本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
26.除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
27.实施例1
28.本实施例对前列腺炎和前列腺癌患者静脉血血清中有机酸代谢物含量进行检测，具体如下：
29.1.受试者纳入标准
30.前列腺炎患者(prostatitis组)纳入标准：1)具有典型的临床症状：尿急、尿频、尿痛；2)前列腺液常规检查结果异常；3)肝肾功能等未见异常，没有接受过药物的治疗或手术切除。
31.前列腺癌患者(pca组)纳入标准：1)行血清前列腺特异性抗原(psa)、直肠指检、前列腺超声、多参数磁共振扫描等检查，前列腺穿刺活检病理学明确诊断；无其他系统疾病，无合并其他恶性肿瘤病史；2)前列腺癌分期参照2017年美国癌症分期联系委员会制定的tnm分期系统；3)所有患者未经任何放疗、化疗、手术去势、药物去势者及手术切除。
32.根据上述标准，pca组纳入52例，平均年龄为77.81
±
8.49岁；prostatitis组纳入37例，平均年龄为52.05
±
12.35岁。
33.所有受试者都签署患者知情同意书，本次研究经过广州市番禺区中心医院伦理委员会批准。
34.2.样品采集
35.上述所有纳入研究的受试者术前抽取清晨空腹静脉血(采血前1周禁行直肠指诊、按摩、穿刺等检查操作)3ml，收集血清并在-80摄氏度下保存至分析。从受试者的记录中回顾性收集患者信息和相关实验室检查指标。
36.3.代谢组学分析
37.基于超高效液相色谱-串联质谱(lc-ms/ms)的平台分析用甲醇提取的血清中的提取物，并结合uhplc-三重四极杆质谱靶向分析有机酸。质谱下机原始数据通过proteowizard软件包(v3.0.8789)4中msconvert工具将原始质谱raw文件转换为mzxml文件格式。采用rxcms软件包回进行峰检测、峰过滤、峰对齐处理，得到物质定量列表。采用公共数据库hmdb、metlin、massbank、lipidmaps、mzcloundi、kegg及自建物质库进行物质的鉴定。基于qc样本的loess信号校正方法实现数据矫正，消除系统误差。数据质控中过滤掉qc样本中rsd》30％的物质。具体如下：
38.(1)标准曲线制作
39.称取相关有机酸标准品，用甲醇配制单标母液。量取各母液适量制成混合标准品，用30v/v％甲醇水溶液(含0.1w/v％甲酸)逐一稀释至合适浓度，制成工作标准溶液。柠檬酸、l-焦谷氨酸、dl-3-苯基乳酸、乙基丙二酸、3-羟基-3-甲基谷氨酸、马尿酸标准品信息及工作标准溶液浓度点如表1和表2所示。母液及工作标准溶液均保存于0℃。
40.表1准品信息
[0041][0042]
表2标准品浓度(单位:ng/ml)
[0043][0044][0045]
(2)血清样品处理
[0046]
吸取血清样品于2ml ep管中，准确加入400μl 30v/v％甲醇水溶液(含0.1w/v％甲酸)，涡旋震荡60s，12000rpm 4℃离心10min，取上清液加入到检测瓶中。
[0047]
(3)检测参数
[0048]
色谱条件：采用acquitybeh c18色谱柱，进样量为5μl，柱温为40℃，流动相a-水(含0.1％甲酸)，b-甲醇水(含0.1％甲酸)。梯度洗脱条件为0～6min，28％b；6～9min，25～40％b；9～10min，40～50％b；10～11min，50％b；11～12min，28％b。流速：0.25ml/min。
[0049]
质谱条件：电喷雾电离(esi)源，负离子电离模式。离子源温度500℃，离子源电。-4500v，碰撞气6psi，雾化气和辅助气均为50psi。采用多重反应监测(mrm)进行扫描。用于定量分析的离子对见下表3。
[0050]
表3用于分析的定量离子对
[0051][0052]
分别对各工作标准溶液和样品进行检测。以工作标准溶液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，考察线性范围及绘制标准曲线，得到回归方程，分别如下：
[0053]
柠檬酸：y＝-5580+332*x，r＝0.9965；
[0054]
l-焦谷氨酸：y＝-414.7+21.005*x，r＝0.9964；
[0055]
dl-3-苯基乳酸：y＝-1822.7+2156.3*x，r＝0.9969；
[0056]
乙基丙二酸：y＝-9280+16400*x，r＝0.9956；
[0057]
3-羟基-3-甲基谷氨酸：y＝-931.98+467.41*x，r＝0.9977；
[0058]
马尿酸：y＝-1540+1570*x，r＝0.9918。
[0059]
根据上述回归方程和各物质对应的峰面积计算样品中柠檬酸、l-焦谷氨酸、dl-3-苯基乳酸、乙基丙二酸、3-羟基-3-甲基谷氨酸、马尿酸的含量。
[0060]
4.统计分析
[0061]
采用r软件包ropls分别对样本数据进行主成分分析(pca)、偏最小二乘判别分析(pls-da)、正交偏最小二乘判别分析(opls-da)降维分析。根据t检验计算p-value值、pls-da降维方法计算变量投影重要度(vip)、foldchange计算组件差异倍数，衡量各代谢物组分含量对样本分类判别的影响强度和解释能力，辅助标志代谢物的筛选。当p-value值《0.05和vip值》1时，认为代谢物分子具有统计学意义。
[0062]
使用受试者工作特征曲线(roc)下的面积(auc)来评估模型在每次比较中识别患者的诊断准确性。auc《0.5时，表示指标无诊断意义；auc＝0.5～0.7时，表示指标诊断准确性较低；auc＝0.7～0.9时，表示指标诊断准确性中等；auc》0.9时，表示指标诊断准确性高。
[0063]
5.结果
[0064]
统计分析结果显示，柠檬酸、l-焦谷氨酸、dl-3-苯基乳酸、乙基丙二酸、3-羟基-3-甲基谷氨酸、马尿酸在前列腺炎和前列腺癌患者静脉血血清中的含量具有显著差异。其中，与前列腺炎患者相比，前列腺癌患者静脉血血清中柠檬酸(图1)、乙基丙二酸(图4)、3-羟基-3-甲基谷氨酸(图5)、马尿酸(图6)的含量显著上升，而l-焦谷氨酸(图2)、dl-3-苯基乳酸(图3)则是显著下降。提示上述指标可作为区别前列腺炎和前列腺癌患者的生物标志物。
[0065]
进一步利用auc来评估指标在每次比较中识别疾病的诊断准确性。结果显示：柠檬
酸的auc为0.926，特异性为82.7％，敏感性为91.9％；l-焦谷氨酸的auc为0.864，特异性为75％，敏感性为83.8％；dl-3-苯基乳酸的auc为0.850，特异性为73.1％，敏感性为91.9％；乙基丙二酸的auc为0.843，特异性为78.8％，敏感性为86.5％；3-羟基-3-甲基谷氨酸的auc为0.817，特异性为73.1％，敏感性为81.1％；马尿酸的auc为0.791，特异性为75％，敏感性为73％。以上结果表明柠檬酸、l-焦谷氨酸、dl-3-苯基乳酸、乙基丙二酸、3-羟基-3-甲基谷氨酸、马尿酸可作为区分前列腺炎和前列腺癌患者的特异性标志物，准确性较高(auc在0.7～0.9之间)，尤其是柠檬酸，其auc高达0.926，说明诊断准确性高。因此，定量检测患者静脉血中柠檬酸、l-焦谷氨酸、dl-3-苯基乳酸、乙基丙二酸、3-羟基-3-甲基谷氨酸、马尿酸含量的试剂可用于制备区分前列腺炎和前列腺癌患者的试剂盒。
[0066]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。