一种区分前列腺癌和良性前列腺增生的标志物及试剂盒的制作方法

1.本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种区分前列腺癌和良性前列腺增生的标志物及试剂盒。


背景技术：

2.前列腺癌是指发生在前列腺的上皮性恶性肿瘤，其病理类型上包括腺癌(腺泡腺癌)、导管腺癌、尿路上皮癌、鳞状细胞癌、腺鳞癌，其中前列腺腺癌占95％以上，通常所说的前列腺癌就是指前列腺腺癌。前列腺癌列男性恶性肿瘤发病率的第6位，发病年龄在55岁前处于较低水平，55岁后逐渐升高，发病率随着年龄的增长而增长，高峰年龄是70～80岁。
3.前列腺癌早期常无症状，随着肿瘤的发展，前列腺癌引起的症状可概括为两大类：(1)压迫症状：逐渐增大的前列腺腺体压迫尿道可引起进行性排尿困难，表现为尿线细、射程短、尿流缓慢、尿流中断、尿后滴沥、排尿不尽、排尿费力；此外，还有尿频、尿急、夜尿增多、甚至尿失禁。肿瘤压迫直肠可引起大便困难或肠梗阻，也可压迫输精管引起射精缺乏，压迫神经引起会阴部疼痛，并可向坐骨神经放射。(2)转移症状：前列腺癌可侵及膀胱、精囊、血管神经束，引起血尿、血精、阳痿。盆腔淋巴结转移可引起双下肢水肿。前列腺癌常易发生骨转移，引起骨痛或病理性骨折、截瘫。前列腺癌也可侵及骨髓引起贫血或全血象减少。
4.目前临床诊断前列腺癌的检查方法均存在一定的缺陷：前列腺液(eps)常规检查、肛诊、b超、磁共振扩散加权成像、尿流动力学等方法过于繁琐；病理组织活检具有一定的创伤性和侵入性，会对人体的产生较大的伤害；血清中前列腺特异性抗原的检测缺乏特异性和灵敏度。此外，早期前列腺癌的症状与另一种常见的男性生殖系统疾病良性前列腺增生的症状类似，因此容易导致误诊，使得早期前列腺癌不能被有效识别，从而错过了最佳的治疗时机。
5.代谢组学作为系统生物学的一个重要分支，同时也是基因组学、转录组学和蛋白质组学的补充，主要通过高通量检测和数据处理的方式，将信息建模与系统整合起来的一种学科。代谢组学能够识别分子量小于1000d的代谢物，比如糖类、脂质类、维生素类等。通过它们代谢水平的变化来判断出对应生物体内处于某一时期的病理生理状态，此状态的小分子代谢物就可以成为标志物，对疾病的筛查及早期诊断提供有效的帮助。因此，找到一种用于区分前列腺癌和良性前列腺增生的高效、便捷的生物学标志物对于早期前列腺癌的辅助诊断具有重要意义。


技术实现要素：

6.基于此，本发明的目的在于，提供一种区分前列腺癌和良性前列腺增生的标志物及试剂盒，所述标志物在前列腺癌和良性前列腺增生患者血清中的含量具有显著差异，可用于前列腺癌和良性前列腺增生的辅助诊断，具有采样方便和检测快速等优点。
7.具体技术方案如下：
8.标志物在制备区分前列腺癌和良性前列腺增生的试剂中的应用，所述标志物选自dl-3-苯基乳酸和l-焦谷氨酸中的至少一种。
9.进一步地，所述标志物为dl-3-苯基乳酸和l-焦谷氨酸。
10.进一步地，所述试剂适用于超高效液相色谱-串联质谱检测技术。
11.本发明还提供了一种区分前列腺癌和良性前列腺增生的标志物组合，所述标志物组合为dl-3-苯基乳酸和l-焦谷氨酸。
12.本发明还提供了一种区分前列腺癌和良性前列腺增生的试剂盒，所述试剂盒包含用于定量检测样品中标志物含量的试剂；所述标志物选自dl-3-苯基乳酸和l-焦谷氨酸中的至少一种。
13.进一步地，所述标志物为dl-3-苯基乳酸和l-焦谷氨酸。
14.进一步地，所述试剂盒适用于超高效液相色谱-串联质谱检测技术。
15.进一步地，所述试剂盒还包括针对所述标志物的标准品。
16.进一步地，所述样品为血清。
17.进一步地，所述试剂盒还包括样品前处理试剂，所述样品前处理试剂为含0.1w/v％甲酸的30v/v％甲醇水溶液。
18.本发明通过研究发现，前列腺癌患者静脉血血清中dl-3-苯基乳酸和l-焦谷氨酸的含量明显低于良性前列腺增生患者，差异具有统计学意义。进一步通过受试者工作特征(roc)曲线分析发现，dl-3-苯基乳酸和l-焦谷氨酸可以单独作为区分前列腺癌和良性前列腺增生的检测标志物，具有较好的准确性：dl-3-苯基乳酸的roc曲线下的面积(auc)为0.758，特异性为94.2％，敏感性为57.7％；l-焦谷氨酸的auc为0.782，特异性为88.5％，敏感性为65.4％。当dl-3-苯基乳酸和l-焦谷氨酸联合使用时，诊断性能进一步提高：auc为0.815，特异性为88.5％，敏感性为67.3％。本发明提供了一种新的有效区分前列腺癌和良性前列腺增生的检测标志物，可用于前列腺癌和良性前列腺增生的辅助诊断，具有采样方便和检测快速等优点。
附图说明
19.图1为前列腺癌(pca组)和良性前列腺增生(bph组)患者血清中dl-3-苯基乳酸和l-焦谷氨酸的z-score图。
20.图2为前列腺癌和良性前列腺增生患者血清中dl-3-苯基乳酸含量的统计分析结果和roc曲线图。
21.图3为前列腺癌和良性前列腺增生患者血清中l-焦谷氨酸含量的统计分析结果和roc曲线图。
22.图4为dl-3-苯基乳酸和l-焦谷氨酸联合用于区分前列腺癌和良性前列腺增生患者时的roc曲线图。
具体实施方式
23.本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
24.除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域
的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
25.本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
26.实施例1
27.本实施例检测前列腺癌和前列腺炎患者血清中dl-3-苯基乳酸和l-焦谷氨酸的含量，具体如下：
28.1.受试者纳入标准
29.前列腺癌患者(pca组)纳入标准：1)行血清前列腺特异性抗原(psa)、直肠指检、前列腺超声、多参数磁共振扫描等检查，前列腺穿刺活检病理学明确诊断；无其他系统疾病，无合并其他恶性肿瘤病史；2)前列腺癌分期参照2017年美国癌症分期联系委员会制定的tnm分期系统；3)所有患者未经任何放疗、化疗、手术去势、药物去势者及手术切除。
30.前列腺良性增生患者(bph组)纳入标准：1)直肠指诊及前列腺b超显示前列腺体积增大；2)有排尿不畅，尿频，夜尿增多，进行性排尿困难，部分患者有尿潴留病史，无合并其他恶性肿瘤病史；3)所有患者均行尿道前列腺电切术，术后病理组织诊断证实为良性前列腺增生。
31.根据上述标准，pca组52例，平均年龄为77.81
±
8.49岁；bph组纳入52例，平均年龄为66.08
±
11.02岁。
32.所有受试者都签署患者知情同意书，本次研究经过广州市番禺区中心医院伦理委员会批准。
33.2.样品采集
34.上述所有纳入研究的受试者术前抽取清晨空腹静脉血(采血前1周禁行直肠指诊、按摩、穿刺等检查操作)3ml，收集血清并在-80摄氏度下保存至分析。从受试者的记录中回顾性收集患者信息和相关实验室检查指标。
35.3.代谢组学分析
36.基于超高效液相色谱-串联质谱(lc-ms/ms)的平台分析用甲醇提取的血清中的提取物，并结合uhplc-三重四极杆质谱靶向分析有机酸。质谱下机原始数据通过proteowizard软件包(v3.0.8789)4中msconvert工具将原始质谱raw文件转换为mzxml文件格式。采用rxcms软件包回进行峰检测、峰过滤、峰对齐处理，得到物质定量列表。采用公共数据库hmdb、metlin、massbank、lipidmaps、mzcloundi、kegg及自建物质库进行物质的鉴定。基于qc样本的loess信号校正方法实现数据矫正，消除系统误差。数据质控中过滤掉qc样本中rsd》30％的物质。具体如下：
37.(1)标准曲线制作
38.称取dl-3-苯基乳酸和l-焦谷氨酸标准品，用甲醇配制单标母液。量取各母液适量制成混合标准品，用30v/v％甲醇水溶液(含0.1w/v％甲酸)稀释至合适浓度，制成工作标准溶液。dl-3-苯基乳酸和l-焦谷氨酸的标准品信息及工作标准溶液浓度点如表1和表2所示。母液及工作标准溶液均保存于0℃。
39.表1 dl-3-苯基乳酸和l-焦谷氨酸标准品信息
40.名称英文名称cas号dl-3-苯基乳酸dl-3-phenyllactic acid828-01-3l-焦谷氨酸l-pyroglutamic acid98-79-3
41.表2 dl-3-苯基乳酸和l-焦谷氨酸标准品浓度(单位:ng/ml)
[0042][0043]
(2)血清样品处理
[0044]
吸取血清样品100μl于2ml ep管中，加入400μl 30v/v％甲醇水溶液(含0.1w/v％甲酸)，涡旋震荡60s，12000rpm 4℃离心10min，取上清液加入到检测瓶中。
[0045]
(3)检测参数
[0046]
色谱条件：采用acquitybeh c18色谱柱，进样量为5μl，柱温为40℃，流动相a-水(含0.1％甲酸)，b-甲醇水(含0.1％甲酸)。梯度洗脱条件为0～6min，28％b；6～9min，25～40％b；9～10min，40～50％b；10～11min，50％b；11～12min，28％b。流速：0.25ml/min。
[0047]
质谱条件：电喷雾电离(esi)源，负离子电离模式。离子源温度500℃，离子源电。-4500v，碰撞气6psi，雾化气和辅助气均为50psi。采用多重反应监测(mrm)进行扫描。用于定量分析的离子对见下表3。
[0048]
表3用于分析的定量离子对
[0049]
检测物质母离子子离子dpepcecxpdl-3-苯基乳酸164.915146.6-60-10-16-13l-焦谷氨酸127.95582-45-10-20-3 15
[0050]
分别对各工作标准溶液和样品进行检测。以工作标准溶液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，考察线性范围及绘制标准曲线，得到回归方程，分别如下：
[0051]
dl-3-苯基乳酸：y＝-1822.7+2156.3*x，r＝0.9969；
[0052]
l-焦谷氨酸：y＝-414.7+21.005*x，r＝0.9964；
[0053]
根据上述回归方程和各物质对应的峰面积计算样品中dl-3-苯基乳酸和l-焦谷氨酸的含量。
[0054]
4.统计分析
[0055]
采用r软件包ropls分别对样本数据进行主成分分析(pca)、偏最小二乘判别分析(pls-da)、正交偏最小二乘判别分析(opls-da)降维分析。根据t检验计算p-value值、pls-da降维方法计算变量投影重要度(vip)、foldchange计算组件差异倍数，衡量各代谢物组分含量对样本分类判别的影响强度和解释能力，辅助标志代谢物的筛选。当p-value值《0.05和vip值》1时，认为代谢物分子具有统计学意义。
[0056]
roc曲线(receiver operating characteristic)，亦名受试者工作特征曲线或感受性曲线，是根据一系列不同的二分类方式(分界值或决定阈)，以真阳性率(灵敏度)为纵
坐标，假阳性率(1-特异度)为横坐标绘制的曲线。代谢组学数据分析获得差异代谢物后，采用roc曲线来评价并筛选潜在的生物标记物。roc曲线下面积(area under curve，auc)被用来评估生物标记物对于预测事件发生的灵敏度和特异性，每个代谢物的灵敏度和特异性由roc曲线的最佳阈值决定。auc值在0.5～1.0之间，auc值越接近于1，预测的准确性越高。通常来说，auc值在0.5～0.7时预测准确性较低，auc值在0.7～0.9时有一定预测准确性，auc值在0.9以上时有较高预测准确性。
[0057]
5.结果
[0058]
图1为前列腺癌和良性前列腺增生患者dl-3-苯基乳酸和l-焦谷氨酸的z-score图。
[0059]
前列腺癌患者静脉血血清中dl-3-苯基乳酸的含量明显低于良性前列腺增生患者(图2)，差异具有统计学意义。roc曲线分析结果显示，其在用于区分前列腺癌和良性前列腺增生患者时，auc为0.758，特异性为94.2％，敏感性为57.7％。
[0060]
如图3所示，l-焦谷氨酸在前列腺癌患者静脉血血清中的含量也显著低于良性前列腺增生患者，roc曲线分析结果显示，其在用于区分前列腺癌和良性前列腺增生患者时，auc为0.782，特异性为88.5％，敏感性为65.4％。
[0061]
进一步分析dl-3-苯基乳酸和l-焦谷氨酸组合在用于区分前列腺癌和良性前列腺增生患者时，auc为0.815，特异性为88.5％，敏感性为67.3％，诊断性能进一步提高(图4)。
[0062]
上述结果表明，dl-3-苯基乳酸和l-焦谷氨酸能满足作为区分前列腺癌和良性前列腺增生患者的生物标志物的要求；尤其是两者联合使用时，可以获得更好的诊断效果。
[0063]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。