一种羟苯磺酸钙中遗传毒性杂质的定量测定方法与流程

1.本发明属于药物分析领域，具体涉及用柱前衍生化并采用高效液相色谱法分离测定羟苯磺酸钙中杂质的方法。


背景技术：

2.羟苯磺酸钙作为长期用于临床的毛细血管保护药，自身结构式中含有对二酚羟基结构，很容易被氧化，一旦与水或空气中的氧气接触，很容易被氧化而产生2-磺酸基-1,4-苯醌杂质，即使样品放置于4℃温控进样器内，溶液中2-磺酸基-1,4-苯醌仍迅速增加，导致样品结果超出限度，且无法判定超限原因为样品本身不合格还是配制过程导致。该杂质具有遗传毒性结构，需要进行控制，且该杂质为新的化合物，国内外未有报道，为本公司合成部自制，具体制备过程如下：
[0003][0004]
在室温(20～25℃)、氮气保护、机械搅拌下将浓硫酸(29.4g)缓慢滴加入对苯二酚(20g)的环己烷(100g)溶液中，滴毕，加热至70～80℃反应0.5小时，冷却至室温，分离出环己烷，加入乙腈(200ml)溶解固体，溶清后，控制内温＜30℃下加入二氧化锰(80g)，室温下搅拌反应12小时。反应完毕，将反应液倾入冰无数乙醇中(400ml，2v/v)，过滤除去二氧化锰残渣，所得滤液再加入到冰水中(800ml，4v/v，以反应液体积计)，再采用0.45微米滤膜过滤，所得滤液冻干得到2-磺酸-1,4-苯醌黄色粉末状固体。采用核磁共振氢谱、高分辨质谱、电感耦合等离子测定确定了其化学结构，详细图谱参见图1～3。
[0005]
另外，羟苯磺酸钙的起始物料氢醌，与羟苯磺酸钙结构相似，自身也易被氧化而产生1,4-苯醌，该组分也具有遗传毒性结构需要进行控制。经查询《the carcinogenic potency database》数据库，1,4-苯醌的td
50
数据为5.07mg/kg/d；根据ich m7指导原则计算杂质限度，1,4-苯醌的ttc(毒理学控制阈值)为5.07μg/d，本品的日最大剂量为1.5g/d，因此制定1,4-苯醌限度均为3.38ppm；2-磺酸基-1,4-苯醌与1,4-苯醌结构相似，且均具有相同的警示结构，因此其限度也为3.38ppm。
[0006]
因此，为保证药物的安全性，必须对上述两个杂质进行控制。但是2-磺酸基-1,4-苯醌与1,4-苯醌两个遗传毒性杂质，属于痕量组分，不易被检出；另外羟苯磺酸钙以及微量杂质氢醌，由于自身基团性质活泼，容易被氧化，而2-磺酸基-1,4-苯醌与1,4-苯醌具有较强的氧化性，因此四个组分在溶液中无法共存。
[0007]
首先对于1,4-苯醌定量，由于1,4-苯醌与羟苯磺酸钙在溶液状态下发生氧化还原反应无法共存，将原料供试品溶液中定量加入1,4-苯醌后，系统适用性溶液中1,4-苯醌未出峰，而2-磺酸基-1,4-苯醌与氢醌则明显增加(如图4所示)，可见1,4-苯醌在溶液状态下与羟苯磺酸钙迅速完全反应生成2-磺酸基-1,4-苯醌与氢醌，因此不仅无法对1,4-苯醌的
定量，同时还干扰2-磺酸基-1,4-苯醌的定量。
[0008]
另外对于2-磺酸基-1,4-苯醌定量，由于1,4-苯醌的存在，羟苯磺酸钙溶液中测得的2-磺酸基-1,4-苯醌，无法明确该组分来源为羟苯磺酸钙本身还是溶液配制过程中的反应产物。同时羟苯磺酸钙溶液配制成溶液后，2-磺酸基-1,4-苯醌会不断增加，继续放置，该杂质仍会增加，表明溶液状态下主成分羟苯磺酸钙不稳定，会被不断氧化产生2-磺酸基-1,4-苯醌，进一步增加了该杂质定量的难度。
[0009]
此外在羟苯磺酸钙、2-磺酸基-1,4-苯醌、氢醌与1,4-苯醌四个结构式相近，且极性均较大，在反相液相上保留较弱，出峰时间很短，同时因杂质限度较低，需要将样品液配制很高的浓度，才能满足定量的要求，导致液相色谱图中羟苯磺酸钙峰的峰宽较大，待测杂质会被包含于羟苯磺酸钙主峰内，难以分离(如图5所示)。
[0010]
综上，需要开发一种能够有效分离并准确检测羟苯磺酸钙、2-磺酸基-1,4-苯醌、氢醌与1,4-苯醌四个组分的方法。


技术实现要素：

[0011]
本发明的目的在于提供一种羟苯磺酸钙中杂质的定量测定方法，该方法使能够有效分离并准确检测羟苯磺酸钙中2-磺酸基-1,4-苯醌与1,4-苯醌两个组分，以保证羟苯磺酸钙原料及制剂的安全性。
[0012]
本发明所述的羟苯磺酸钙中杂质的定量测定方法，所述杂质为2-磺酸基-1,4-苯醌与1,4-苯醌，
[0013]
采用液相色谱进行分离测定，供试品相经过衍生化试剂进行衍生化，再加入溶剂配置成供试品溶液；所述的溶剂为10％～80％的乙腈水溶液，所述的衍生化试剂通过如下方法制备获得：取2,4-二硝基苯肼加入体积分数为80-90％的磷酸溶液0.4～0.6ml，再加入乙腈混匀，制得含2,4-二硝基苯肼浓度为0.1mg/ml～10mg/ml的溶液即为衍生化试剂。
[0014]
在一种具体的实例中，本发明所述的羟苯磺酸钙中杂质的定量测定方法，所述杂质为2-磺酸基-1,4-苯醌与1,4-苯醌，采用液相色谱进行分离测定，色谱条件如下：
[0015]
色谱柱：封端的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；
[0016]
检测波长为：300nm～400nm；
[0017]
流速：0.8～1.2ml/min；
[0018]
柱温：0℃～40℃；
[0019]
流动相：以ph4.5
±
0.5的缓冲盐溶液-乙腈的混合溶液作为流动相，缓冲盐溶液与乙腈的体积比为80:20～35:65；
[0020]
2-磺酸基-1,4-苯醌与1,4-苯醌对照品溶液：取2-磺酸基-1,4-苯醌与1,4-苯醌，加溶剂制备成二者的混合溶液，加入衍生化试剂1～10ml，衍生化1h～24h后，加溶剂配制成0.1～0.2μg/ml的对照品溶液；
[0021]
供试品溶液：取供试品，加入衍生化试剂1～10ml，衍生化1h～24h后，加溶剂配制成0.03～0.05g/ml供试品溶液；
[0022]
所述的溶剂为10％～80％的乙腈水溶液，所述的衍生化试剂通过如下方法制备获得：取2,4-二硝基苯肼加入体积分数为80-90％的磷酸溶液0.4～0.6ml，再加入乙腈混匀，制得含2,4-二硝基苯肼浓度为0.1mg/ml～10mg/ml的溶液即为衍生化试剂。
[0023]
本发明所述的色谱柱可以选择本领域常用的封端的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，例如牌号phenomenex gemini c
18
色谱柱(规格4.6mm
×
250mm，5μm)。
[0024]
本发明所述的流动相中的ph4.5
±
0.5的缓冲盐溶液为磷酸盐缓冲溶液、醋酸盐缓冲溶液或三乙胺缓冲溶液，优选为磷酸二氢铵缓冲溶液。这些缓冲盐溶液可以按照本领域常规方法配制或者直接购买。
[0025]
本发明所述的2,4-二硝基苯肼的摩尔量，确保可以大于2-磺酸基-1,4-苯醌和1,4-苯醌摩尔总量的2倍，优选为2-磺酸基-1,4-苯醌和1,4-苯醌摩尔总量的2～5倍。
[0026]
在一些实施例中，本发明衍生化5～6h，更优选的衍生化4.5～5.5h；
[0027]
在一些实施例中，本发明所述的流动相缓冲盐溶液与乙腈的体积比为(45～55)：(47.5～52.5)，优选为50:50。
[0028]
在一些实施例中，本发明所述的检测波长为378nm
±
5nm。
[0029]
在一些实施例中，本发明所述的流速为0.8～1.2ml/min。
[0030]
在一些实施例中，本发明所述的柱温为25℃
±
5℃。
[0031]
在一些实施例中，本发明所述的溶剂为20％～35％的乙腈水溶液。
[0032]
本发明所述的方法，进一步的，取供试品溶液和对照品溶液各5μl～20μl，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图，按照外标法计算样品中2-磺酸基-1,4-苯醌和1,4-苯醌的量。
[0033]
本发明通过柱前衍生化处理，一方面可以使杂质2-磺酸基-1,4-苯醌、1,4-苯醌与2,4-二硝基苯肼反应(如下式)，1,4-苯醌与2,4-二硝基苯肼反应不再与羟苯磺酸钙反应而干扰2-磺酸基-1,4-苯醌的定量；同时样品中2-磺酸基-1,4-苯醌与2,4-二硝基苯肼生成不同的苯腙化合物，可以实现目标组分2-磺酸基-1,4-苯醌与1,4-苯醌的同时定量检测。另一方面，衍生化处理过程主成分羟苯磺酸钙与干扰组分氢醌不仅参与反应，且衍生化试剂可以抑制羟苯磺酸钙与氢醌的自身氧化，维持羟苯磺酸钙与氢醌的稳定性，使之形成溶液也不会发生氧化反应，从而实现羟苯磺酸钙与氢醌的定量检测。通过衍生化处理，2-磺酸基-1,4-苯醌与1,4-苯醌反应得到的苯腙类化合物极性增加，在反相体系中保留增强，而羟苯磺酸钙与氢醌未参与反应，极性未改变，因此可实现四个组分的有效分离。
[0034]
本方法所述的方法可以成功的定量两个苯醌类杂质，羟苯磺酸钙和氢醌由于未参与衍生化反应，极性较大，在溶剂峰位置处已出峰，可以实现有效的分离。
[0035][0036]
本发明的有益效果：
[0037]
(1)本发明通过衍生化处理，使杂质2-磺酸基-1,4-苯醌、1,4-苯醌与2,4-二硝基苯肼反应形成极性增加的不同的苯腙，同时羟苯磺酸钙与氢醌自身氧化被抑制，溶液中羟苯磺酸钙、2-磺酸基-1,4-苯醌、氢醌与1,4-苯醌均能保持稳定，且极性形成差异，可实现四种成分的分离。
[0038]
(2)本发明的衍生化反应室温下5h便可以反应完全，反应条件较为温和，时间可控。
[0039]
(3)本发明通过衍生化处理后，再用采用乙腈-水来溶解样品溶液，不仅可以使样品溶解完全，同时确保目标杂质提取完全，且避免样品中羟苯磺酸钙被再次氧化，保证溶液的稳定性。
[0040]
(4)本方法操作方便，经过方法验证，方法专属性好，灵敏度高，精密准确，利用本发明的方法可以准确的对羟苯磺酸钙的基因毒性杂质2-磺酸基-1,4-苯醌、1,4-苯醌的定量分析，从而保证了羟苯磺酸钙原料及制剂的质量可控性。
附图说明
[0041]
图1为基因毒性杂质2-磺酸-1,4-苯醌锰盐的核磁共振氢谱(1h-nmr)图。
[0042]
图2为基因毒性杂质2-磺酸-1,4-苯醌锰盐的高分辨质谱(hrms)图。
[0043]
图3为基因毒性杂质2-磺酸-1,4-苯醌锰盐的电感耦合等离子直读光谱(icp)图。
[0044]
图4为羟苯磺酸钙供试品溶液及基因毒性杂质定位对比图。
[0045]
图5为苯醌类杂质与羟苯磺酸钙出峰图。
[0046]
图6为实施例1羟苯磺酸钙原料中2-磺酸基-1,4-苯醌及1,4-苯醌杂质测定对照品溶液图谱。
[0047]
图7为实施例1羟苯磺酸钙原料中2-磺酸基-1,4-苯醌及1,4-苯醌杂质测定空白溶剂图谱。
[0048]
图8为实施例1羟苯磺酸钙、氢醌、2-磺酸基-1,4-苯醌衍生物及1,4-苯醌衍生物uv全波长扫描对比图谱。
[0049]
图9为实施例1羟苯磺酸钙原料中不同检测波长下羟苯磺酸钙的响应对比图谱。
1,4-苯醌衍生化产物与前后杂质之间的分离度为4.4和4.2，1,4-苯醌衍生化产物与前后杂质之间的分离度为4.0和4.8，达基线分离(见图6和图7)。
[0071]
结果表明，衍生化试剂对样品检测无干扰，且由于1,4-苯醌和2-磺酸基-1,4-苯醌的衍生物极性的差异，两个待测组分在反相色谱中可完全分离。
[0072]
(2)考察已知组分的干扰
[0073]
另外为考察羟苯磺酸钙与氢醌对基因毒性杂质测定的干扰，需要将羟苯磺酸钙与氢醌在相同色谱条件下进样，观察是否在两个待测组分附近处出峰。但是根据羟苯磺酸钙、氢醌、2-磺酸基-1,4-苯醌衍生物及1,4-苯醌衍生物的uv扫描图(见图8)可知，四个组分的紫外吸收的差异较大，羟苯磺酸钙与氢醌在300nm波长处有最大吸收，而1,4-苯醌衍生物和2-磺酸基-1,4-苯醌衍生物在378nm处有最大吸收，因此选择378nm作为检测波长时，羟苯磺酸钙与氢醌的色谱图几乎无响应，无法观察到羟苯磺酸钙与氢醌的出峰位置(见图9～10)。
[0074]
取供试品溶液、氢醌定位溶液与对照品溶液的紫外响应最大的检测波长的色谱图进行对比(见图11)，三个溶液的检测波长分别为300nm、300nm、378nm，供试品溶液配制方法同1.5，氢醌定位溶液为0.1mg/ml，对照品溶液配制方法同1.5，结果可知羟苯磺酸钙和杂质氢醌均在衍生化试剂2,4-二硝基苯肼组分峰前的位置出峰，而待测杂质1,4-苯醌对照品和2-磺酸基-1,4-苯醌2,4-二硝基苯肼组分均在2,4-二硝基苯肼组分峰后的位置出峰，因此样品中主成分与氢醌均不会对待测杂质的检测产生干扰；
[0075]
综上可知，由于1,4-苯醌和2-磺酸基-1,4-苯醌能与衍生化试剂反应，生成了稳定的且极性更小的衍生化合物，而羟苯磺酸钙与氢醌未参与衍生化反应，极性未改变，从而排除了样品中已知组分对检测的干扰。
[0076]
1.2线性与范围试验
[0077]
精密称取1,4-苯醌对照品和2-磺酸基-1,4-苯醌锰盐对照品各适量，置同一量瓶中，加50％乙腈溶解稀释制成一系列浓度的混合标准溶液。分别精密量取1ml，置10ml量瓶中，加衍生化溶液6ml，加25％乙腈稀释至刻度，摇匀，室温条件下反应5h。分别精密量取20μl，照上述色谱条件进样分析，以各成分的定量限浓度作为最低浓度，以供试品溶液(配制方法同1.5)浓度的0.0004％作为各成分的最高浓度，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，结果见表1。结果显示，各成分标准曲线的回归线的相关系数(r)均＞0.990，符合要求。
[0078]
表1线性范围考察结果
[0079]
组分线性方程范围1,4-苯醌a＝3.3349c-0.0234相关系数(r)为0.99980.0274μg/ml～0.1646μg/ml2-磺酸基-1,4-苯醌a＝1.1451c-0.0019相关系数(r)为0.99930.0348μg/ml～0.1669μg/ml
[0080]
1.3检测限和定量限试验
[0081]
取1,4-苯醌对照品和2-磺酸基-1,4-苯醌锰盐对照品各适量，用50％乙腈溶液逐步定量稀释后，再精密量取1ml，置10ml量瓶中，加衍生化溶液6ml，室温条件下反应5h，加25％乙腈稀释至刻度，摇匀，照上述色谱条件进样分析，以各杂质信噪比约为10:1时的相应浓度作为定量限浓度，以信噪比约为3:1时的相应浓度作为检测限浓度，结果1,4-苯醌和-磺酸基-1,4-苯醌的定量限分别为：0.024μg/ml、0.031μg/ml，检测限分别为0.007μg/ml和0.010μg/ml，远低于杂质限度浓度0.135μg/ml。
[0082]
1.4溶液稳定性试验
[0083]
精密量取供试品溶液(配制方法同1.5)和对照品溶液(配制方法同1.5)，分别放置0h、2h、4h、6h、8h后，分别精密量取20μl，照上述色谱条件进样分析，结果显示，对照品溶液与供试品溶液放置8h内，峰面积无明显变化，与0时相比，比值均在0.8～1.2范围内，对照品溶液与供试品溶液放置8h内稳定。该结果可表明在加入衍生化试剂后，对照品与供试品溶液中1,4-苯醌对照品和2-磺酸基-1,4-苯醌均以衍生物的形式稳定存在于溶液中；特别是供试品溶液中羟苯磺酸钙在加入衍生化试剂后，抑制了主成分自身氧化，2-磺酸基-1,4-苯醌杂质不再增加，各组分均能在溶液中单独稳定存在。
[0084]
1.5准确度试验
[0085]
取1,4-苯醌对照品和2-磺酸基-1,4-苯醌锰盐对照品各适量，加50％乙腈溶液溶解并定量稀释制成每1ml中各约含1,4-苯醌和2-磺酸基-1,4-苯醌各1.4μg的溶液，作为对照品贮备液。取样品(批号：20190701批)约400mg，12份，精密称定，置10ml量瓶中，分别加加衍生化溶液6ml，再分别精密加入上述贮备液0ml、0.8ml、1.0ml和1.2ml(各3份)，室温条件下反应5h，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；再分别精密量取对照品贮备液1ml，至10ml量瓶中，加衍生化溶液6ml，室温条件下反应5h，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。精密量取对照品溶液和供试品溶液各20μl，照上述色谱条件进样分析，计算低、中、高三种杂质浓度水平的供试液中1,4-苯醌和2-磺酸基-1,4-苯醌的回收率，结果1,4-苯醌低、中、高三种浓度水平的平均回收率分别为：107.7％、106.0％、103.4％，平均回收率(n＝9)为105.7％，rsd(n＝9)为2.0％；2-磺酸基-1,4-苯醌低、中、高三种浓度水平的平均回收率分别为：99.0％、94.2％、92.1％，平均回收率(n＝9)为95.1％，rsd(n＝9)为6.0％。结果显示：1,4-苯醌和2-磺酸基-1,4-苯醌在供试品溶液中均可单独稳定存在，定量加入供试品中仍可被准确检测，见图12，本方法准确度较好，具体分析如下：
[0086]
(1)在加入衍生化试剂后，1,4-苯醌不再与羟苯磺酸钙反应，而是生成了稳定的1,4-苯醌衍生物；因而加样供试品溶液定量加入1,4-苯醌后，该杂质仍能检出，且回收率符合要求。
[0087]
(2)在加入衍生化试剂后，可抑制供试品溶液中主成分自身氧化和与1,4-苯醌反应，同时2-磺酸基-1,4-苯醌与衍生化试剂反应生成了稳定的2-磺酸基-1,4-苯醌衍生物，因而加样供试品溶液后定量加入2-磺酸基-1,4-苯醌后，该杂质回收率符合要求。
[0088]
1.6精密度试验
[0089]
由另一个试验人员，于不同日期，使用不同仪器和不同色谱柱，照准确度项下试验，结合准确度项下结果，两个人员测得的1,4-苯醌回收率结果rsd(n＝18)为4.2；2-磺酸基-1,4-苯醌回收率结果rsd(n＝18)为9.4。表明，本方法精密度好。
[0090]
1.7耐用性试验
[0091]
分别考察衍生化时间变化
±
10％、衍生化试剂浓度变化
±
10％、检测波长变化
±
5nm、柱温变化
±
5℃、流速相对值变化
±
20％、磷酸二氢铵的量变化
±
10％，乙腈的量变化
±
5％以及使用两根不同批号色谱柱测定时，仪器色谱行为的变化(在供试品溶液中按限度的量标准加入对照品，考察1,4-苯醌和2-磺酸基-1,4-苯醌的回收率)。结果显示，各条件下，1,4-苯醌与2-磺酸基-1,4-苯醌的回收率均在80％～120％范围内。结果表明，本方法耐用性好。
[0092]
1.8样品测定
[0093]
取2-磺酸基-1,4-苯醌锰盐对照品和1,4-苯醌对照品各适量，加50％乙腈溶解并制成每1ml含2-磺酸基-1,4-苯醌和1,4-苯醌各1.4μg的混合溶液，精密量取1ml，置10ml量瓶中，加衍生化溶液6ml，加水稀释至刻度，摇匀，室温条件下反应5h，作为对照品溶液。取羟苯磺酸钙原料供试品适量，置10ml量瓶中，加衍生化溶液6ml，室温条件下反应5h，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。分别精密量取20μl，照上述色谱条件进样分析。按外标法计算各样品中2-磺酸基-1,4-苯醌和1,4-苯醌的量。结果20190701、20190702、20191101三批原料中1,4-苯醌均未检出，2-磺酸基-1,4-苯醌均小于3.38ppm，符合规定。见图13。
[0094]
由于1,4-苯醌与2-磺酸基-1,4-苯醌属于痕量杂质，当氢醌与羟苯磺酸钙自身极微量的氧化，都会导致样品中1,4-苯醌与2-磺酸基-1,4-苯醌检验结果超限，样品被判定不合格。因此必须保证羟苯磺酸钙与氢醌与羟苯磺酸钙在溶液中能稳定存在，根据实施例1中溶液稳定性可知，原料供试品溶液中1,4-苯醌与2-磺酸基-1,4-苯醌的检出量并没有随着溶液放置时间的延长而发生明显改变，表明氢醌与羟苯磺酸钙在样品衍生化之后可保持稳定，并没有被氧化。
[0095]
实施例2本发明所述的羟苯磺酸钙片中的2-磺酸基-1,4-苯醌和1,4-苯醌含量测定。
[0096]
取2-磺酸基-1,4-苯醌锰盐对照品和1,4-苯醌对照品各适量，加50％乙腈溶解并制成每1ml含2-磺酸基-1,4-苯醌和1,4-苯醌各1.4μg的混合溶液，精密量取1ml，置10ml量瓶中，加衍生化溶液6ml，加水稀释至刻度，摇匀，室温条件下反应5h，作为对照品溶液。取羟苯磺酸钙片供试品适量，置10ml量瓶中，加衍生化溶液6ml，室温条件下反应5h，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液。取羟苯磺酸钙片空白辅料适量，同法配制，作为空白辅料溶液。分别精密量取20μl，照上述色谱条件进样分析。按外标法计算各样品中2-磺酸基-1,4-苯醌和1,4-苯醌的量。结果空白辅料对测定无干扰，191101s、191102s、191103s三批样品中2-磺酸基-1,4-苯醌及1,4-苯醌均未检出，符合规定。见图14和图15。