一种用于检测烟草黑胫病菌的酶联免疫试剂盒及其应用

1.本发明涉及农业生物技术领域，涉及一种烟草黑胫病菌的酶联免疫定量检测试剂盒的制备及其应用。


背景技术：

2.烟草黑胫病(phophhro nicotinae breda de hann)于1896年首次发现于印尼爪哇，现已是世界性烟草的毁灭性病害之一，从苗期到成株期都可发生。烟草黑胫病又被称为黑秆疯、乌头病等，是由烟草疫霉(phytophthora nicotianae)引起的较为严重的土传真菌性病害，由于烟草黑胫病分布广泛、田间潜伏时间长等原因，烟株经过病菌的侵害后会出现叶片枯萎变黄、叶片腐烂、茎秆褐变甚至植株死亡等现象，并且烟草在整个生育期都可能受到疫霉的危害，对烟叶产量和内在品质造成了严重影响，并且造成极大的经济损失，是烟叶毁灭性病害之一。
3.检测烟草黑胫病菌传统的方法主要是以病原菌形态及生理生化特征进行检测。随着分子生物学的发展，以pcr为基础的分子生物学鉴定被广泛应用。但不论是传统的方法还是分子生物学鉴定都对操作人员的专业素养要求较高，无法广泛普及，无法对烟草黑胫病菌进行现场快速检测。
4.酶联免疫检测技术(elisa试剂盒检测方法)是20世纪60年代末期发展起来的一种免疫学检测方法，是目前最广泛应用的标记免疫技术。1966年nakene和pierce共同发表了《酶标抗体：制备和抗原定位中的应用》，首先提出了酶联免疫技术(elisa试剂盒检测方法)的基本原理。1971年engvall和perlmann发表《elisa kit方法吸附试验测定igg含量》一文，使酶联免疫(elisa试剂盒检测)技术成为一种实用的检测液体标本中微量物质的方法。目前酶联免疫(elisa试剂盒)检测技术已广泛用于免疫学、微生物学、寄生虫学等。由于其具有灵敏度高、试剂稳定、设备简单、操作安全等优点，近几年也将其应用到食品领域中来检测某些食品中的生理活性物质。


技术实现要素：

5.为了对烟草黑胫病菌进行快速筛选检测，本发明提供一种烟草黑胫病菌的酶联免疫定量检测试剂盒的制备及其应用。
6.为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
7.方案一：将烟草黑胫病菌经过培养得到烟草黑胫病菌菌丝和孢子；用该菌丝孢子诱导免疫新西兰大白兔，通过获取兔血清，并经过纯化，得到兔多克隆抗体；用该菌丝孢子诱导免疫6周龄的雌性balb/c小鼠，再用免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞sp2/0融合，通过筛选获得特异性单克隆抗体细胞株，通过制备腹水的方式，经过纯化获得特异性单克隆抗体；用双抗体夹心的elisa方法，筛选配对抗体；通过优化得到elisa试剂盒体系，建立双抗体夹心的elisa方法；生产试剂盒，对实际样本进行检测。
8.方案二：本发明提供一种检测烟草黑胫病菌的试剂盒，所述试剂盒包含第一方面
所述的单克隆抗体和多克隆抗体。
9.优选地，所述试剂盒包括如下组分：
10.(1)方案一所述的单克隆抗体预包被酶标板
11.(2)样品稀释液，其为磷酸盐缓冲液；
12.(3)洗涤液，其为含tween-20的磷酸盐缓冲液；
13.(4)反应终止液，其为h2so4溶液；
14.(5)酶标抗体，为辣根过氧化物酶(hrp)标记的第一方面所述的多克隆抗体；
15.(6)显色剂为tmb显色剂；
16.(7)烟草黑胫病菌标准品。
17.包被抗体和酶标抗体分别为方案一所述的单克隆抗体合多克隆抗体，组分(1)中，所述抗体预包被酶标板的制备过程如下：
18.(1)将抗体稀释到一定浓度，加至96孔酶标板，每孔100ul，37℃反应3h；
19.(2)将板孔溶液甩干，加入洗涤液，浸泡5min，将板孔溶液甩干，在吸水纸上拍干；
20.(3)将封闭液加至96孔酶标板，每孔150ul，37℃反应2h；
21.(4)将板孔溶液甩干，在吸水纸上拍干，用冷冻干燥机抽干；
22.(5)用真空包装机包装于铝箔袋中。
23.所述抗体预包被酶标板的制备过程中，所述包被缓冲液为碳酸盐缓冲液；进一步优选地，所述碳酸盐缓冲液为na2co
3-nahco3缓冲液，其浓度为0.1m，ph值为9.6。
24.所述抗体为方案二所述的单克隆抗体对的第一单克隆抗体或第二单克隆抗体。
25.所述抗体的包被浓度为1.8～2.2μg/ml、优选1.9～2.1μg/ml、更优选2μg/ml。
26.所述封闭液为含bsa的碳酸盐缓冲液。
27.组分(5)中，所述酶标抗体为第二所述的单克隆抗体对的第二单克隆抗体或第一单克隆抗体，且被hrp标记；
28.所述酶标抗体的浓度为8～12μg/ml、优选9～11μg/ml、更优选10μg/ml；
29.加入抗体后的孵育温度为22～26℃、优选25℃，孵育时间为40～50分钟、优选45分钟。
30.组分(7)中所述烟草黑胫病菌标准品为将烟草黑胫病菌经过培养获得的菌丝。
31.组分(4)中所述硫酸为1.8～2.2m、优选1.9～2.1m、更优选2m的硫酸。
32.方案三：本发明提供一种检测烟草黑胫病菌的方法，采用方案二所述的试剂盒，包括如下步骤：
33.(1)从待检样本中提取蛋白，得蛋白提取液；
34.(2)用第四方面所述试剂盒对蛋白提取液进行检测，其主要过程包括加样、孵育、洗涤、加酶、孵育、洗涤、显色、终止和读数。
35.(3)通过用烟草黑胫病菌标准品制作的浓度-吸光度标准曲线，计算待检样品中的烟草黑胫病菌浓度。
36.本发明的有益效果：本发明提供的抗体对特异性强、灵敏度高，效价高，可特异性对烟草中的烟草黑胫病菌进行精准定量检测，鉴定结果准确、可靠，灵敏度高，为烟草作物培养和推广应用奠定了基础，检测方法简单快速，为大规模育种后代选择的现场检测提供了有力保障。并且本发明的抗体也可应用于wb、elisa、ip等实验。
附图说明
37.图1是使用本发明方法检测烟草黑胫病菌的标准曲线。
具体实施方式
38.下文以示例性地方式对本发明进行更详细地描述。
39.本发明实施例涉及的试剂、抗体、质粒、仪器如下表1：
40.表1主要试剂、抗体、质粒及仪器
41.[0042][0043]
实施例1、烟草黑胫病菌的培养
[0044]
(1)病菌的分离与获取
[0045]
分别从宜宾市兴文县、筠连县、珙县烟田采集发病植株，累计采集83株病株，利用组织分离法成功分离到70株烟草黑胫病菌，经形态特征和分子鉴定为烟草疫霉(phytophtora nicotianae)。
[0046]
(2)病菌的培养和菌丝孢子的获取
[0047]
取活化的烟草疫霉菌丝块，接种于15ml燕麦培养基平板上，28℃下培养10-12天。将长满菌丝的培养基划成2mm
×
3mm矩形小块，挑入装有30ml皮氏液的无菌培养皿中，每皿挑10块。置入26℃温箱中暗培养，3d后在菌丝块边缘(已经长出白色絮状体)用移液枪吸取10μl培养液。将已诱发出大量孢子囊的培养皿在4℃冰箱中放置1h，随后继续放入26℃培养箱中暗培养24h。用2层纱布过滤，用移液枪吸取10μl滤液，分别滴在血球计数板上，计算出各处理游动孢子的含量。
[0048]
实施例2、抗体制备
[0049]
(1)多抗制备
[0050]
1、免疫原制备：将菌丝孢子与等体积的弗氏佐剂、youlong佐剂混合乳化均匀，成油包水状态，以备免疫兔子。
[0051]
2、免疫策略：将菌丝孢子免疫2只新西兰大白兔，皮下免疫3次，间隔4周，最后经间
接elisa检测。
[0052]
间接elisa方法步骤为：
[0053]
1)用0.1mol/l，ph＝9.6的碳酸盐缓冲液稀释菌丝孢子至1ug/ml，加入96孔酶标板，每孔100ul，37℃反应3h或者4℃静置过夜。
[0054]
2)甩去板孔中液体，加入250ul洗涤缓冲液，静置30s，甩去板中液体，重复3次。
[0055]
3)加入检测样本，每孔100ul，同时加入阳性对照(步骤(2)中所取阳性兔血清)、阴性对照(免疫前兔血清)和空白对照(不加兔血清)37℃反应45min，
[0056]
4)重复步骤2)；
[0057]
5)加入hrp标记的羊抗兔酶标二抗，每孔100ul，37℃反应45min。
[0058]
6)重复步骤2)；
[0059]
7)加入显色剂，每孔100ul，室温避光反应15min。
[0060]
8)加入终止液，每孔100ul，使用酶标仪在波长450读取od值，抗血清效价如下表2：
[0061]
表2抗血清效价
[0062][0063]
3、多克隆抗体纯化：兔血清离心15min(4000rpm，室温)，取上清，在4℃搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至半饱和，继续搅拌30min，离心30min(13000rpm，4℃)，弃上清；沉淀溶于适量pbs(0.01m,ph7.4)；在4℃搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至33％，继续搅拌30min，离心30min(13000rpm，4℃)，弃上清；沉淀溶于适量pbs(0.01m,ph7.4)，4℃透析过夜，测定抗体含量，-20℃冻存备用。硫酸铵沉淀后继续采用proteina小柱进行纯化，新柱子先用5ml超纯水过柱，再用5ml 0.4m pb缓冲液(ph 7.0)平衡纯化小柱；抗体过柱，过程中要求缓慢过柱，以求抗体蛋白更好的结合在结合位点上；继续10ml 0.4m pb缓冲液(ph 7.0)平衡纯化小柱；5ml 0.1m甘氨酸-盐酸缓冲液(ph 3.0)洗脱结合位点上的抗体，并加入1m tris-hcl(ph 8.0)中和甘氨酸，使ph保持为适合抗体保存的中性。
[0064]
(2)单抗制备
[0065]
1、免疫原制备：将菌丝孢子与等体积的弗氏佐剂、youlong佐剂混合乳化均匀，成油包水状态，以备免疫小鼠。
[0066]
2、免疫策略：将菌丝孢子免疫4只balb/c小鼠，皮下免疫3次，间隔4周，最后经间接elisa检测。
[0067]
间接elisa方法步骤为：
[0068]
1)用0.1mol/l，ph＝9.6的碳酸盐缓冲液稀释菌丝孢子至1ug/ml，加入96孔酶标板，每孔100ul，37℃反应3h或者4℃静置过夜。
[0069]
2)甩去板孔中液体，加入250ul洗涤缓冲液，静置30s，甩去板中液体，重复3次。
[0070]
3)加入检测样本，每孔100ul，同时加入阳性对照(步骤(2)中所取阳性小鼠血清)、
阴性对照(免疫前小鼠血清)和空白对照(不加小鼠血清)37℃反应45min，
[0071]
4)重复步骤2)；
[0072]
5)加入hrp标记的羊抗鼠酶标二抗，每孔100ul，37℃反应45min。
[0073]
6)重复步骤2)；
[0074]
7)加入显色剂，每孔100ul，室温避光反应15min。
[0075]
8)加入终止液，每孔100ul，使用酶标仪在波长450读取od值，抗血清效价如下表3：
[0076]
表3抗血清效价
[0077][0078]
3、细胞融合：最后一次免疫后两周，腹腔注射抗原进行加强免疫，三天后进行细胞融合。将小鼠断颈处死，70％乙醇浸泡30min消毒，在超净台剪开腹腔，取出脾脏，磨碎，过80目筛网，得到脾细胞，加入sp2/0骨髓瘤细胞，在peg4000的作用下进行细胞融合，
[0079]
4、融合筛选：将融合好的细胞铺进96孔板，用hat培养液进行培养，三天后换液，改用ht培养液培养。10天后，取细胞培养上清进行检测。
[0080]
5、克隆化与建株：使用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，10天后检测，将阳性克隆继续有限稀释法进行克隆化，直到得到的克隆都为阳性，可建立阳性细胞株。最终获得阳性细胞株5株。
[0081]
6、扩大培养：将建株的单克隆细胞扩大培养，并进行冻存。
[0082]
(3)腹水制备与纯化
[0083]
1、腹水制备：提前一周在小鼠腹腔注射矿物油，将一定数量的细胞注射入小鼠腹腔，10天左右收集腹水，4000rpm离心，得上清即为单克隆抗体腹水。
[0084]
2、单克隆抗体纯化：腹水离心15min(4000rpm，室温)，取上清，在4℃搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至半饱和，继续搅拌30min，离心30min(13000rpm，4℃)，弃上清；沉淀溶于适量pbs(0.01m,ph7.4)；在4℃搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至33％，继续搅拌30min，离心30min(13000rpm，4℃)，弃上清；沉淀溶于适量pbs(0.01m,ph7.4)，4℃透析过夜，测定抗体含量，-20℃冻存备用。硫酸铵沉淀后继续采用protein g小柱进行纯化，新柱子先用5ml超纯水过柱，再用5ml 0.4m pb缓冲液(ph 7.0)平衡纯化小柱；抗体过柱，过程中要求缓慢过柱，以求抗体蛋白更好的结合在结合位点上；继续10ml 0.4m pb缓冲液(ph 7.0)平衡纯化小柱；5ml 0.1m甘氨酸-盐酸缓冲液(ph 2.7)洗脱结合位点上的抗体，并加入1mtris-hcl(ph 8.0)中和甘氨酸，使ph保持为适合抗体保存的中性。
[0085]
(4)抗体筛选
[0086]
1、效价检测
[0087]
以间接elisa方法对纯化后的抗体进行效价检测，结果如下表4：
[0088]
2、亚型检测
[0089]
用小鼠抗体亚型检测试剂盒对抗体进行亚型检测，结果如下表4：
[0090]
表4抗体亚型检测
[0091][0092][0093]
3、抗体配对
[0094]
应用双抗夹心的elisa方法对制备得到的抗体进行筛选，筛选出可以配对的抗体对。
[0095]
双抗夹心的elisa方法如下：
[0096]
a、用cb将包被抗体稀释至10ug/ml，每孔100ul，37℃包被3h；
[0097]
b、洗板3-5次，拍干，加入阳性标品/阴性对照/阳性样本/阴性样本，每孔100ul，25℃反应45min。
[0098]
c、洗板3-5次，拍干，加入酶标抗体，每孔100ul，25℃反应45min。
[0099]
d、洗板3-5次，拍干，加入显色剂，25℃避光反应15min。
[0100]
e、加入100ul终止液，od450读取od值，结果见表5：
[0101]
表5抗体配对
[0102][0103][0104]
其中fl3601-16的配对效果最好，因此采用fl3601-16与兔多抗来制备试剂盒。
[0105]
实施例3、本发明试剂盒的组装：
[0106]
1、缓冲液的配制
[0107]
(1)包被缓冲液，0.1m碳酸盐缓冲液cb，ph值为9.6；
[0108]
(2)稀释液，0.01mm磷酸盐缓冲液pbs，ph值为7.4；
[0109]
(3)洗涤液，含0.2％吐温-20的pbs；
[0110]
(4)封闭液，含1％bsa的cb；
[0111]
(5)终止液，2m h2so4；
[0112]
2、酶标板的制备
[0113]
(1)包被
[0114]
移取一定量烟草黑胫病菌单克隆抗体于所需体积的包被液中，使其浓度约为2μg/ml，配置成包被工作液。将包被工作液按每孔100μl加入酶标板微孔，4℃静置过夜(注意要防止水分蒸发)。
[0115]
(2)封闭
[0116]
在cb缓冲液(ph9.6)中加入一定量的bsa，水杨酸钠，蔗糖，使bsa，水杨酸钠，蔗糖的浓度分别为1％，0.05％，5％，配置成封闭工作液。酶标板以洗板机吸干、洗涤二次，将板条在洁净的吸水纸上拍干。将封闭工作液按每孔150μl加入微孔，37℃烘焙3小时。
[0117]
(3)抽干密封
[0118]
弃去封闭液，将板条在洁净的吸水纸上拍干，放入冷冻真空干燥机抽干3小时，真空热封。
[0119]
3、烟草黑胫病菌标准品冻干粉的制备
[0120]
培养获得的烟草黑胫病菌菌丝，其母液浓度为3mg/ml，稀释到16μg/ml，3ml棕色玻璃瓶加入100μl 16μg/ml标准品，冷冻干燥机过夜抽干得到标准品冻干粉。
[0121]
4、酶标记抗体工作液的配置
[0122]
酶标抗体的制备：取纯化的烟草黑胫病菌多克隆抗体，与hrp进行偶联，得到酶标记抗体。辣根过氧化物酶(hrp)标记的烟草黑胫病菌多克隆抗体的制备方法为：
[0123]
(1)5mg hrp溶于纯水，加入高碘酸钠，室温反应30分钟；
[0124]
(2)将5mg抗体用偶联缓冲液透析过夜；
[0125]
(3)将hrp加入抗体溶液中，室温反应2小时；
[0126]
(4)加入硼氢化钠封闭反应位点；
[0127]
(5)磷酸盐缓冲液透析过夜，加入等量甘油保存于-20℃。
[0128]
取一定量的酶标记抗体加入到稀释液中，充分混匀，使其终浓度为2μg/ml，2-8℃避光保存；
[0129]
5、试剂盒的组装，见表6：
[0130]
表6试剂盒组装
[0131]
名称数量预包被酶标板1块标准品冻干粉2瓶酶标记抗体工作液1瓶样品稀释液2瓶显色剂1瓶终止剂1瓶洗涤液1瓶说明书1份
[0132]
实施例4、使用本发明试剂盒检测烟草黑胫病菌加标样本
[0133]
(1)准备标准品和加标样品
[0134]
1)标准品配制：
[0135]
用2ml样品提取液溶解烟草黑胫病菌标准品，此溶液浓度为8ppm；
[0136]
取烟草黑胫病菌标准品8ppm，300μl加入样品提取液300μl，此溶液浓度为4ppm；
[0137]
取烟草黑胫病菌标准品4ppm，300μl加入样品提取液300μl，此溶液浓度为2ppm；
[0138]
取烟草黑胫病菌标准品2ppm，300μl加入样品提取液300μl，此溶液浓度为1ppm；取烟草黑胫病菌标准品1ppm，300μl加入样品提取液300μl，此溶液浓度为0.5ppm。
[0139]
2)加标样品的处理：
[0140]
样本前处理方法：称取1g阴性样本，捣碎后放入15ml离心管中，加入10ml的提取液，振荡混匀5分钟，4000rpm离心3分钟，取上清作为阴性样品提取液。
[0141]
在阴性样品提取液中加入一定量的高浓度菌丝溶液，配置成阳性加标样品用于检测。
[0142]
(2)加标准品或未知浓度样品：
[0143]
将100μl的样品稀释液(空白对照)/标准品/阳性加标样品加入到对应的微孔中，轻轻振荡混匀，25℃避光环境中反应45min。
[0144]
(3)洗板：
[0145]
将孔内液体甩干，用250μl洗涤液/孔充分洗涤3次，每次间隔1min，用吸水纸拍干。
[0146]
(4)加酶标抗体：
[0147]
加入酶标抗体100μl/孔，轻轻振荡混匀，25℃避光环境中反应45min，取出重复洗板步骤3。
[0148]
(5)显色：
[0149]
加入显色剂100μl/孔，置于25℃避光环境中反应15min。
[0150]
(6)终止与测定：
[0151]
加入100μl终止液/孔，轻轻振荡混匀，酶标仪设定至450nm，测定每孔od值(优选用双波长450/630nm进行检测，在5min内读完数据)。若无酶标仪，则不加终止液用目测法可进行判定。
[0152]
(7)计算：
[0153]
利用统计学绘图软件，根据所测定的标准品的od值绘制标准曲线；通过标准曲线和样品的od值就可计算出样品中烟草黑胫病菌的浓度。
[0154]
(8)结果如表7所示。
[0155]
表7加标样品检测效果
[0156][0157]
由表7结果可知，使用本发明的试剂盒和方法检测植物中的烟草黑胫病菌，其加标回收率在85％-120％之间，说明：本发明的检测植物中的烟草黑胫病菌的方法具有较好的准确性。
[0158]
实施例5、使用本发明试剂盒检测植物中的烟草黑胫病菌
[0159]
敏感性试验：5份阳性血清各作1:10、1:100、1:1000、1:10000、1:100000、1:1000000稀释，然后用优化好的条件进行检测，并寻找检测结果为阳性的最大血清稀释度作为敏感性试验的结果。结果显示抗体稀释10000倍后仍可以被检测到，其灵敏度高达0.1-1mg/l
[0160]
表8烟草黑胫病菌抗体配对灵敏度测定
[0161]
样本稀释12345ck0.08980.08850.09630.07920.0947101.47291.44711.83461.38491.90211000.62150.62270.89080.55330.826110000.31960.32020.69160.42750.6418
100000.19320.18670.27560.22590.24591000000.09390.09080.12210.10480.107610000000.08550.08270.09410.08080.0929
[0162]
综上所述，本发明提供的单克隆抗体特异性强、灵敏度高，效价高，可特异性对植物中的烟草黑胫病菌进行精准定量检测，鉴定结果准确、可靠，灵敏度高，检测方法简单快速，为大规模现场检测提供了有力保障。
[0163]
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明，但本发明并不局限于上述，即不意味着本发明必须依赖上述才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。