生物分子检测方法、生物分子检测装置以及分析用设备的制造方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及使用了电流测量的生物分子检测方法以及装置。
【背景技术】
[0002]对血浆、淋巴液、组织液等体液中包含的细胞因子、荷尔蒙、蛋白质、核算等生物分子的量进行定量，或者检测体液中含有的微量生物分子，是疾病的早期诊断或者病症的准确掌握所必不可少的。
[0003]癌(非专利文献I)、神经系统的疾病(非专利文献2)、感染症的感染初期时(非专利文献3)的情况中，认为在血清中存在的蛋白质的浓度为从10-16到10-12M。在生物分子的定量或者检测中，通常主要进行使用ELISA法、化学发光法或者流式细胞仪的微球分析等，但是，即使检测灵敏度低，也为10-12M左右(非专利文献4)，对疾病早期诊断的应用非常受限制。
[0004]例如，假定通常的血液检查，设被检验者的血清试样为50ul左右时，在10-17M(1aM)的标记的情况下仅存在约300个分子，与测量浓度相比更需要计数分子数量的技术，但这样的技术现在没有实用化，期待具有aM数量级的检测灵敏度的检测技术被实用化。
[0005]专利文献I中公开一种使用流式细胞仪来求取捕捉了抗原的微粒子的数量的方法。
[0006]另外，近些年，提出对10ul中只存在10-20个分子的试样(浓度换算为10-19M)也能够使用抗原-抗体反应来检测的数字ELISA (digital ELISA)方法(非专利文献5)。该方法通过固定了抗体的磁微粒子捕捉抗原(检测对象的生物分子)后，使之与附有生物素的第二抗体反应，进而与附有抗生蛋白链菌素的半乳糖酶反应，向磁微粒子上导入酶。接着，将该微粒子放入将光纤束末端蚀刻而列阵状设置了微小的孔的结构中，使化学发光基质与其作用，由此求取通过光纤的其化学发光亮点数，计数抗原的分子数量。
[0007]现有技术文献
[0008]专利文献
[0009]专利文献1:日本专利第4748542号
[0010]非专利文献
[0011]非专利文献1:Srinivas, P.R.，Kramer, B.S.&Srivastava, S.Trends inb1marker research for cancer detect1n.Lancet Oncol.2, 698-704(2001).
[0012]非专利文献 2:Galasko, D.B1markers for Alzheimer’s disease - clinicalneeds and applicat1n.J.Alzheimers Dis.8, 339-346(2005).
[0013]非专利文献3:Barletta, J.Μ.，Edelman, D.C&Constantine, Ν.T.Loweringthe detect1n limits of HIV-1viral load using real-time immuno—PCR forHIV-lp24antigen.Am.J.Clin.Pathol.122，20-27(2004).
[0014]非专利文献4:Gil johann, D.A.&Mirkin, C.A.Drivers of b1diagnosticdevelopment.Nature 462, 461-464(2009).
[0015]非专利文献5:David M Rissin et al, Nature B1technology, 28, 1641 (2010).
[0016]非专利文献6:Fologea D.et al., Appl Phys Lett.，91，053901-3 (2007).
[0017]非专利文献7:Romero-Cano, M.S.et al., Journal of Colloid and InterfaceScience, 198，266-272(1998).
【发明内容】
[0018]发明要解决的课题
[0019]专利文献I公开的方法中，若考虑光学系统则并行化并不现实，测量可能需要时间。另外，非专利文献5公开的方法中，虽然在某种程度上可以并行处理，但是通过一次检测可检测的分子数受到光纤数量，即阵列状的微小孔数限制。因此，存在当试样浓度低时需要浓缩，相反，当浓度高时需要稀释等，需要检测前的浓度调整这样的在实际应用中处理变得复杂的问题。
[0020]鉴于上述课题而作出本发明，提供一种对检测对象的生物分子逐一计数的方法，特别提供一种无需事先调整试样浓度，作业简便的检测方法。
[0021]用于解决课题的手段
[0022]经本发明的发明人悉心研究，开发出对检测对象的生物分子逐一进行分子计数的方法，且其计数的分子数量没有限制的方法。
[0023]具体来说，是如下方法:在固定了大量检测用抗体的电荷保持体上捕捉生物分子后，与电荷保持体上固定了第二抗体的结构反应，由此，生成经由生物分子连接两个电荷保持体的电荷保持体的缔合体，利用在基板上设置了多个组合了电场效应型晶体管和孔隙的检测部的设备，并行检测电荷保持体缔合体。通过设置多个检测部，即使检测对象分子数量增加也可以充分对应。
[0024]发明效果
[0025]本发明提供一种在现有检测方法中无法实现的、对检测对象的生物分子逐一对其分子数进行计数的检测方法。
[0026]特别是，通过使用电场效应型晶体管进行检测，使检测部容易并行化，可以容易地使检测闻速化。例如，在Imm角的基板上可以容易地以Ium的间距制作电场效应型晶体管和孔隙，例如容易在I秒内检测出10万个通过孔隙的电荷保持体复合体，因此，在10分钟内平均可以检测出6X1013个电荷保持体复合体。例如，若设检体为50ul的血清，则作为摩尔浓度，可以在从高浓度IuM到低浓度laM(30分子/50ul)的大范围内用同样的方法进行测量。
[0027]此外，对电场效应型晶体管中电荷保持体通过孔隙而产生的电流变化进行检测，因此完全不需要光学系统，与以往的萤光检测相比，容易实现装置的小型化，并且可以廉价地制造。
【附图说明】
[0028]图1是用于说明本发明的检测方法的一例的图。
[0029]图2是用于说明本发明的检测设备的结构的一例的图。
[0030]图3是用于说明本发明的检测设备的结构的一例的图。
[0031]图4是说明本发明的检测设备的概念的图。
[0032]图5是表示本发明的检测设备的制造方法的图。
[0033]图6是表示本发明的检测设备的制造方法的图。
[0034]图7是表示本发明的检测设备的制造方法的图。
[0035]图8是表示本发明的检测设备的制造方法的图。
[0036]图9是表示本发明的检测设备的制造方法的图。
[0037]图10是表示本发明的检测设备的制造方法的图。
[0038]图11是表示本发明的检测设备的制造方法的图。
[0039]图12是表示本发明的检测设备的制造方法的图。
[0040]图13是表示本发明的检测设备的制造方法的图。
[0041]图14是表示本发明的检测设备的制造方法的图。
[0042]图15是表示本发明的检测设备的制造方法的图。
[0043]图16是说明本发明的检测设备的结构的图。
[0044]图17是说明本发明的检测设备的结构的图。
[0045]图18是说明本发明的检测设备的结构的图。
[0046]图19是说明本发明的检测设备的结构的图。
[0047]图20是用于说明本发明的检测方法的一例的图。
[0048]图21是用于说明本发明的检测方法的一例的图。
[0049]图22是用于说明本发明的检测装置的结构的一例的图。
[0050]图23是用于说明本发明的检测方法以及装置的结构的一例的图。
【具体实施方式】
[0051]本实施例中公开一种生物分子检测方法，其特征在于，使检测对象的生物分子与表面上具有针对所述生物分子的第一抗体的电荷保持体、以及表面上具有针对所述生物分子的2次抗体的电荷保持体进行反应，测量所述电荷保持体的各自的电荷量，由此检测所述电荷保持体的复合体，评价所述生物分子的存在量。这里，评价生物分子的存在量的意思是对分子个数进行计数。因此，当测量对象为液体且知道全体的容积或量时，与浓度测量的意义相同。
[0052]此外，在其他实施例中公开一种生物分子检测方法，其特征在于，使检测对象的生物分子与表面上具有针对所述生物分子的电荷保持体、以及表面上具有针对所述生物分子的2次抗体的电荷保持体进行反应而得到反应液，相对于在基板表面上设置2个对置电极，在所述电极之间设有贯通所述基板的孔隙的基板，所述反应液从基板的一面侧通过所述贯通的孔隙流动到另一面侧，通过测量所述电极间的电流，检测所述电荷保持体的复合体，评价所述生物分子的存在量。
[0053]此外，在实施例中公开了一种生物分子检测方法，其特征在于，在基板表面上设置绝缘膜、控制栅极、源极、漏极、通道以及相对于具有所述控制栅极、所述源极、所述漏极、所述通道的平面，从该平面的一面侧向另一面侧贯通的孔隙，是通过所述控制栅极给所述通道带来电场效应的电场效应晶体管，所述贯通的孔隙被配置在所述控制栅极中所述通道侧的侧面与所述通道中所述控制栅极侧的侧面附近之间，使所述反应液流入所述贯通的孔隙，