用于检测牛奶中β-内酰胺酶的方法及检测试纸的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫检测技术领域，具体为一种用于检测牛奶中目-内醜胺酶的方法 及试纸条。 技术背景
[0002] 目-内醜胺酶（目-lactamase)是常见的市售解抗剂中的主要成分，它由革兰氏阳 性细菌产生和分泌，可选择性地分解用于牛奶中的目-内醜胺类抗生素，是我国不允许使 用的食品添加剂。
[0003] 为了防止奶畜养殖的过程中乳房炎等常见疾病，目-内醜胺类抗生素是被经常使 用的抗生素药物之一。而国家规定在生鲜乳收购环节中需要检测抗生素，并要求不得超过 最高残留限量。如果超标，按规定乳品企业不允许收购该些生乳。在经济利益的驱使下，市 场上开始出现人为添加目-内醜胺酶来分解抗生素、从而使抗生素超标奶变为合格产品的 违法情况。
[0004] 目-内醜胺酶的违规使用不利于政府和乳品企业监管目-内醜胺类抗生素的滥 用，而抗生素的滥用会造成人体产生药物耐药性等多种不良后果，所W必须禁用目-内醜 胺酶。
[0005] 2009年我国在少数乳制品中检查出含有目-内醜胺酶。当年，国家卫生部等九部 口组成了专项小组，为配合全国打击违法添加非食用物质和滥用食品添加剂专项整治工作 的深入开展，将目-内醜胺酶列入《食品中可能违法添加的非食用物质名单》，并展开了全 国范围内的监管。
[0006] 目前国内现有的标准方法由卫生部及有关科研院所提出，包括杯碟法、液相色 谱-质谱/质谱法、楓量法H种检验方法。但是该些方法均有操作复杂、耗时长和检测成本 高的特点，所W市场上也陆续开始出现适合企业现场快速筛选的方法和产品。而快检产品 中，进口产品占据了绝大多数的市场份额。该些进口快检产品价格昂贵，检测限一般为4U/ mU检测结果判断不直观，且整个检测过程时间较长，极大地增加了企业和政府部口等客户 的经济成本。
[0007] 为了维护广大消费者的身体健康、尽可能地节省国家政府部口和乳品企业的检测 成本，市场急需一种灵敏度高、操作简便、用时短、更加经济有效的e-内醜胺酶检测方法 及其相应产品的出现。
【发明内容】
[0008] 本发明目的是提供一种灵敏度高、操作简便、用时短、更加经济有效的用于检测牛 奶中目-内醜胺酶的方法及检测试纸。
[0009] 为达上述目的，提供了如下的技术方案：
[0010] 一种用于检测牛奶中目-内醜胺酶的方法，利用目-内醜胺酶反应底物与牛奶中 存在的目-内醜胺酶反应，产生青霉喔哇酸；所述青霉喔哇酸取代青霉喔哇酸-BSA，与胶体 金上包被的抗青霉喔哇酸单克隆抗体结合。
[0011] 作为一个优选的方案，检测步骤为：
[0012] (1)、所述目-内醜胺酶反应底物与牛奶反应，形成反应液；
[0013] (2)、将所述反应液与所述胶体金中包被有的所述抗青霉喔哇酸单克隆抗体进行 反应；
[0014] (3)、反应后，加入所述青霉喔哇酸-BSA，观察反应结果。
[0015] 作为进一步的优选的方案，所述检测步骤皆采用水浴加热。
[0016] 作为另一个优选的方案，所述胶体金为冻干的胶体金。
[0017] 本发明还提供了一种目-内醜胺酶检测试纸，包括；样品垫、硝酸纤维膜、吸水垫 和支撑胶板，所述硝酸纤维膜上有检测线和质控线；所述检测线包被青霉喔哇酸-BSA，所 述质控线包被羊抗鼠IgG。
[0018] 作为进一步的优选的方案，所述青霉喔哇酸-BSA的浓度是0. 05?Img/mL。
[0019] 作为另一个进一步的优选的方案，所述羊抗鼠IgG的浓度是0. 1?5mg/mL。
[0020] 与现有技术相比，本发明的检测方法与检测试纸的优点为：
[002。 1.灵敏度高，可W检测牛奶中大于等于4U/mL的目-内醜胺酶，适用于国家标准中 规定的检测上限标准，与目前市场上占主要份额的进口产品灵敏度一致，甚至更高。
[0022] 2.检测方法与检测试纸的操作步骤都十分简单，很大程度上缩短了检测用时。
[002引 3.检测试纸采用消线法判断结果，与采用比色法判断结果相比更直观，不易产生 混淆。
【附图说明】
[0024] 图1为本发明的检测原理示意图；
[00巧]图2为本发明试纸条结构示意图；
[0026] 图3为本发明检测方法的操作过程流程图；
[0027] 图4为本发明的检测试纸结果判定为阴性的示意图；
[0028] 图5为本发明的检测试纸结果判定为阳性的示意图；
[0029] 图6为本发明的检测试纸结果无效的示意图。
【具体实施方式】
[0030] 为使本发明的技术手段、达成目的与功效易于明白了解，下面结合【具体实施方式】， 进一步阐述本发明。
[0031] 1.青霉喔哇酸与载体蛋白的偶联
[0032] 采用邸C-N服法将青霉喔哇酸与载体蛋白（牛血清白蛋白BSA或卵清蛋白OVA) 偶联，制备免疫抗原与包被抗原。称取lOOmg青霉素G，用2血的0. 02M的抑7. 0的PBS完 全溶解，冰浴下滴加1血含有51mg EDC与25. 2mg N服的0. 02M的抑为7. 0的PBS溶液， 继续冰浴避光揽拌2小时。后滴加20 y L的目-琉基己醇终止反应。
[003引将此青霉喔哇酸活泼醋衍生中间产物逐滴加入2血含25mg/mLBSA的0. 02M的 pH7. 0的PBS溶液中，4°C避光揽拌24小时。
[0034] 24小时后将反应物取出，1(TC离也去沉淀，上清于4°C用0. 02M的抑7. 0的PBS透 析3天后冻干保存，作为免疫抗原待用。
[00巧]采用同样的方法用OVA制备青霉喔哇酸-OVA加合物作为包被抗原。
[0036] 2.抗青霉喔哇酸单克隆抗体的制备
[0037] 取6?8周龄雌性Ba化/c小鼠，将作为免疫抗原的青霉喔哇酸-BSA偶联物与等 体积的弗氏完全佐剂乳化，按50ug/只剂量皮下注射，之后每隔3周加强免疫1次，用弗氏 不完全佐剂腹腔注射。融合前3d强化免疫1次，不用佐剂，剂量加倍。细胞融合按常规方 法进行：将Sp2/0多发性骨髓瘤细胞与免疫脾细胞按1 ; 10的比例混合，在50%聚己二醇作 用下融合，HAT培液息浮，分种于96孔培养板中，37C，5%C02培养箱中培养。
[0038] 融合后，待细胞生长到培养孔面积的1/4时，采用分步筛选法筛选杂交瘤细胞。初 筛选择lOmg/L青霉喔哇酸-BSA包被酶标板，被测孔加培养上清，赔育、清洗后，加入酶标羊 抗鼠IgG-HRP (1:1000)，0PD显色。筛选出的阳性孔再用青霉喔哇酸-OVA偶联物包被的 酶标板进行阻断间接化ISA。将细胞培养上清与2 X l(T3mol/L青霉喔哇酸溶液等量混合， 37°C赔育比，加入已包被的酶标板中。另外用PBS (0. Olmol/L、抑7. 4)替代青霉喔哇酸溶 液作为对照，其余步骤同上。若青霉喔哇酸阻断后的0D值降至对照孔的50% W下，则判为 阳性孔。经2?3次检测都呈阳性的孔，立即用有限稀释法进行克隆化。
[0039] 体外培养；将克隆化的细胞株扩大培养，细胞浓度达5 X l〇5/mL时停止换液，收集 细胞。体内诱生腹水；给腹腔注射液体石蜡10天后的小鼠腹腔注射克隆化细胞株1〇7个细 胞，7天后抽取腹水。
[0040] 将腹水与0. 05M PBS (抑7. 4)溶液等体积混合，缓慢揽拌下滴加腹水和PBS总体 积X 0. 818血的饱和硫酸馈，室温揽拌30min ; 1000化pm离也lOmin，