斑马鱼卵黄原蛋白免疫印迹试剂盒及其检测方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生态检测领域，具体涉及一种斑马鱼卵黄原蛋白免疫印迹试剂盒及其检测方法与应用。
【背景技术】
[0002]随着我国工业化程度和人民群众生活水平的不断提高，大量的工业废水和生活污水排入到江河湖海中，造成了严重的水环境污染，不仅危害了野生生物的生存，也严重威胁我国人民的健康。虽然这些污染物在环境中的浓度很低，但是能够干扰人和动物体内激素的合成、释放、运输、代谢，以及激素与受体的结合、功能的表达等一系列生物过程，从而扰乱人和动物内分泌系统、神经系统和免疫系统的机能，甚至对生物后代的生殖功能造成潜在影响，这一类化学物质统称为内分泌扰乱化学物质。其中，环境雌激素对野生动物和人类生殖系统的影响受到了广泛关注，已成为继臭氧层、气候变暖之后的第三大环境问题。环境雌激素种类繁多，包括多氯联苯类、二恶英类、农药类、双酚类、金属化合类、类固醇类等，其中塑化剂、杀虫剂、避孕药等被人们广泛利用，它们的雌激素效应已引起了人们越来越多的关注。近年来，关于环境雌激素污染的报道越来越多。早在1985年，人们就在英国城市污水处理厂下游河流中捕获到了具有雌雄两性特征的斜齿鳊鱼，我国武汉市东湖部分鱼类出现了“雄鱼雌化”现象，并且在长江、太湖、珠三角河流中都检测到了雌激素类物质。环境雌激素除了造成鱼虾生长速度减慢、畸形等现象外，还能够通过生物浓缩、生物积累和生物放大等途径增大浓度，对生物和人类造成更大危害。因此，为了减少环境雌激素的危害，有必要建立化学物质的环境雌激素活性筛选体系，制备能够快速检测雌激素活性的试剂盒。
[0003]美国、欧盟和日本相继建立起以鱼类为模式生物的环境雌激素筛选评价体系，其中卵黄原蛋白(Vitellogenin, Vtg)作为重要的生物筛选指标，已经得到广泛应用。鱼类卵黄原蛋白是卵黄蛋白的前体，是一种大分子量的脂磷聚糖蛋白。通常，卵黄原蛋白只能在卵黄形成期的雌鱼体内检测到，但是雄鱼和幼鱼体内也含有卵黄原蛋白基因，在环境雌激素的诱导下，也能合成和分泌卵黄原蛋白。因此，卵黄原蛋白是环境雌激素筛选的特异性生物标志物，通过检测雄鱼体内卵黄原蛋白水平可以评价环境化合物的雌激素活性。
[0004]斑马鱼(Dan1ree1)，属于福鳍亚纲(Actinopterygii)鲤科(Cyprinidae)短担尼鱼属(Dan1)的一种硬骨鱼，具备以下独特优点:(I)价格便宜，容易获得，并且易于管理；(2)体型小，在较小空间内就可饲养大量斑马鱼(2L的烧杯中就可饲养10条左右)，便于毒理学试验得到较大样本量；(3)斑马鱼对内分泌干扰物反应敏感，内分泌干扰物结构多样，种类众多，并且新的内分泌干扰物不断出现，研宄表明斑马鱼可以作为评价内分泌干扰物的一个模型；(4)斑马鱼的雌雄鱼在体形上较易分辨。雌鱼体型通常较大，腹部较鼓胀；雄鱼体型稍小，腹部平坦。仔细对照可以看出雌鱼臀鳍的条纹是蓝白相间的，而雄鱼臀鳍是蓝纹间夹着深黄色的条纹。目前，斑马鱼已成为一些生态毒理标准(如OE⑶和ISO标准)的推荐测试物种，被广泛地应用于环境毒性试验、环境危险度评价、环境污染物生物累积效应的研宄中。
[0005]研宄表明，环境激素暴露可导致雄性斑马鱼卵黄原蛋白生成、发育迟缓、雌性化、雌雄同体、产卵量减少、受精率降低以及性比失衡等变化，其中卵黄原蛋白可能是最敏感的指标。卵黄原蛋白的测定通常采用免疫学方法，其分离纯化是制备抗体、定性定量检测鱼类卵黄原蛋白的基础。研宄者多通过17 β-雌二醇(17 β-estrad1l，E2)腹腔注射的方法诱导卵黄原蛋白的产生，而斑马鱼体型小，注射困难，血液量少，取血困难，无法获得足够的血浆用于卵黄原蛋白的纯化，这大大制约了斑马鱼卵黄原蛋白抗体的制备。
[0006]目前，研宄者对斑马鱼卵黄原蛋白的定性或定量检测多采用鲤鱼卵黄原蛋白抗体，由于卵黄原蛋白的蛋白质一级结构存在差异，且空间结构也会制约抗原的免疫原性，Watts等(2002)认为大量的转译后修饰会影响鱼类卵黄原蛋白的三级结构，改变抗原决定簇的暴露情况，从而影响不同鱼种卵黄原蛋白之间的种间交叉反应敏感性，使得鱼类卵黄原蛋白抗体在用于其它鱼类卵黄原蛋白检测时受到限制。因此，为了准确反映环境雌激素的存在水平，对不同各类的鱼类，需要制备其相应的卵黄原蛋白抗体。斑马鱼卵黄原蛋白纯品已有国外公司出售，价格为1500元(5yg)，过于昂贵，并且如此小的剂量无法达到抗体制备要求。可见，建立斑马鱼卵黄原蛋白的纯化方法，将成为制备抗体与建立斑马鱼卵黄原蛋白检测的重要前提。
[0007]中国专利201210559592.1提供了一种利用卵黄脂磷蛋白抗体定性检测鱼类卵黄原蛋白的试剂盒，具有显著的检测效果。然而，鱼类卵黄原蛋白是一种种特异性蛋白，不同鱼类的卵黄原蛋白存在较大差异，异源抗体用于其它鱼类卵黄原蛋白检测时会表现出较差的特异性与敏感性，影响检测的效果。因此，为了保证斑马鱼卵黄原蛋白的准确检测，有必要开发一种高效纯化斑马鱼卵黄原蛋白的方法，并制备出具有较高特异性和敏感性的抗斑马鱼卵黄原蛋白抗体。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于提供一种检测斑马鱼卵黄原蛋白的免疫印迹试剂盒及其应用，以满足现有技术的上述需求。
[0009]一种检测斑马鱼卵黄原蛋白的免疫印迹试剂盒，包括一个盒体，该盒体内装有:1)PVDF膜2张；2)辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗I支；3)封闭液、洗涤液、显色液各I支，所述的洗涤液为TBST ;封闭液为含5%脱脂奶粉的TBST ;显色液为含0.06% (m/V)3’ - 二氨基联苯胺的1mM Tris-HCl ;其特征在于该盒体还装有:斑马鱼卵黄原蛋白纯品I支，兔抗斑马鱼卵黄原蛋白多克隆抗体I支。
[0010]所述的斑马鱼卵黄原蛋白纯品为100 μ g/ml的斑马鱼卵黄原蛋白溶液。
[0011]所述的斑马鱼卵黄原蛋白纯品的制备方法如下:
[0012]采用水体暴露17 β -雌二醇的方式诱导斑马鱼产生卵黄原蛋白，将斑马鱼置于2L的玻璃缸中，每缸放入10尾斑马鱼，17 β -雌二醇的暴露浓度为200 μ g/L，每天全部换水，并重新加入相应的17 β -雌二醇，早晚投喂饲料，水温26°C ；7天后将斑马鱼放入50%的酒精中，待斑马鱼麻醉后，取出称重，并加入3倍体积4°C预冷的PBS缓冲液(内含ImM PMSF,PH 7.5)，在冰浴条件下用玻璃匀浆器匀浆，4°C、8000g离心10分钟，收集上清液；将收集的所有上清液用于离子交换层析(DEAE-Sepharose Fast Flow)，用分别含0.07M、0.1M、0.2M和1.0M NaCl的25mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)进行不连续洗脱，收集0.2M洗脱组分，装入截留分子量为10kDa的Millipore超滤离心管，4°C、3000g离心30分钟，加入Iml PBS,收集截留在超滤离心管膜上的蛋白；取Iml收集液加入Sephadex G-200层析柱，用25mMTris-HCl缓冲液(pH 7.5)洗脱，收集第一个主洗脱峰，即为斑马鱼卵黄原蛋白。
[0013]所述的兔抗斑马鱼卵黄原蛋白多克隆抗体的制备方法如下:
[0014]取600 μ g纯化的斑马鱼卵黄原蛋白，加入等体积的弗氏完全佐剂，充分乳化后对新西兰大白兔进行背部皮下多点注射，每点注射0.1ml，两周后再次加强免疫，免疫剂量为600 μ g/只，用弗氏不完全佐剂充分乳化后进行背部皮下注射，此后，每隔10天按以上方法进行加强免疫；第5次注射后于第5天从心脏取血，6000r/min离心20分钟，收集上清，获得了兔抗斑马鱼卵黄原蛋白多克隆抗血清；抗体的纯化分为以下几步，上样前向多克隆抗血清中加入1/3的对照阴性样品(雄鱼匀浆液)，低温振荡2h，4°C过夜，次日离心取上清；向上清中加入等体积的PBS缓冲液；在冰浴条件下加入等体积饱和硫酸铵，0°C震荡2h后，低温离心(8000rpm，15min)，弃上清，沉淀用1ml PBS缓冲液溶解；用0.45微米孔径的滤膜过滤后，上Hitrap Protein G柱，以PBS缓冲液洗脱10个柱体积后，用0.1M甘氨酸(ρΗ2.7)洗脱，即获得兔抗斑马鱼卵黄原蛋白多克隆抗体。
[0015]所述的检测斑马鱼卵黄原蛋白的免疫印迹试剂盒，在环境雌激素类物质筛选与内分泌扰乱化学物质检测中的应用。
[0016]本发明的试剂盒利用抗原抗体之间的特异性结合能力，可灵敏、准确、方便地检测斑马鱼血浆中、肝脏组织和肝细胞培养液中的卵黄原蛋白，最低检出限可达60ng/ml，为内分泌扰乱化学物质筛选、检测和生态环境风险评价提供了一个有效的手段。
[0017]本发明的优点
[0018]目前，国内外多采用异源性(鲤鱼)抗体用于斑马鱼卵黄原蛋白的测定，然而有研宄表明，异源性抗体达不到同源性抗体的检测敏感性。关于斑马鱼卵黄原蛋白抗体制备已有外文文献报道，Fenske等(2001)通过乙炔基雌二醇(17 a-ethiny-lestrad1l，EE2)水体暴露66天的方法诱导斑马鱼产生卵黄原蛋白，然后取血，用于卵黄原蛋白的纯化及抗体的制备，本发明利用200 μ g/L 17 β -雌二醇水体暴露7天的方法即可诱导雄性斑马鱼产生足量的卵黄原蛋白，极大地降低了诱导时间和工作量，并且，本发明直接将斑马鱼匀浆液用于卵黄原蛋白的纯化，不仅减少了实验用鱼的数量(6条斑马鱼即可达到实验目的)，还简化了实验方法。此外，经多个浓度及暴露时间相比较，本发明证实200 μ g/L暴露七天，既达到了斑马鱼的耐受极限，又保证了卵黄原蛋白的较大诱导量。在纯化过程，本发明先通过离子交换层析，经超滤浓缩后，再进分子筛层析，最后再进行超滤浓缩。本实验方案不仅避免了斑马鱼匀浆液堵塞分子筛带来的麻烦，还极大提高了纯化蛋白的浓度，本发现的试剂盒利用抗原抗体之间的特异性结合能力，能够灵敏、方便地定性检测斑马鱼在不同污染物暴露下体内卵黄原蛋白的生成水平，为评价化学物质的环境雌激素效应提供了快捷的手段。
【附图说明】
[0019]图1为本发明的斑马鱼卵黄原蛋白多克隆抗体对雄性与雌性斑马鱼匀浆液的检测结果(泳道I为雌性斑马鱼匀浆液；泳道2为雄性斑马鱼匀浆液)；
[0020]图2为本发明的斑马鱼卵