一种无标记光电化学甲胎蛋白免疫传感器的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种无标记光电化学甲胎蛋白免疫传感器的制备方法。属于新型纳米 功能材料与生物传感器技术领域。
【背景技术】
[0002] 肿瘤标志物的检测可反映肿瘤的生物学特性，是对肿瘤患者的临床治疗及诊断的 关键环节。甲胎蛋白是一种肿瘤标志物，被用来作为诊断原发性肝癌的一个特异性临床指 标。目前，检测甲胎蛋白的方法主要有放射免疫法、质谱法等。此类方法仪器贵重、操作复 杂，化验人员需要专业培训后才能进行检测。因此，研发灵敏度高、特异性强、检测速度快的 甲胎蛋白传感器具有重要意义。
[0003] 光电化学传感器由于灵敏度高、检测成本低等特点，近几年被越来越多的研究者 所关注。光电化学传感器是基于外加光源激发光电敏感材料导致电子-空穴对进行分离， 在合适的偏电位条件下，实现电子在电极、半导体及修饰物和分析物上的快速传递，并形成 光电流。在最优条件下，分析物浓度的变化会直接影响光电流的大小，再利用生物免疫结 合，就可W根据光电流的变化实现对分析物的定性定量分析。
[0004] 光电化学传感器最关键技术就是对光电流的大小及稳定性等性能的提高。基于单 一半导体纳米材料构建的光电化学传感器的灵敏度普遍不高，不利于实际应用。该是由于 单一的半导体纳米材料的光生电子-空穴对易复合，从而导致光电信号的减弱，如二氧化 铁、氧化锋、領系硫族化合物等。但是，在半导体纳米材料上修饰或复合特殊的纳米材料，可 W有效提高光生载流子对的有效浓度，提高光电转换效率，并大大提高检测灵敏度。因此， 设计、制备高效、稳定的半导体及修饰物是制备光电化学传感器的关键技术。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种制备简单、灵敏度高、检测快速、特异性强的无标记光 电化学甲胎蛋白免疫传感器的制备方法，所制备的传感器，可用于甲胎蛋白的快速、灵敏检 巧IJ。基于此目的，本发明先后使用二氧化铁纳米粒子溶胶Ti化NPs和金银纳米棒溶胶Au@Ag NRs对电极进行修饰，然后利用光电化学合成方法，直接快速地制备了金银把合金纳米棒材 料Au@Ag-Pd NDRs，通过戊二酵的交联作用固定甲胎蛋白抗体，在进行检测时，利用抗体与 抗原的特异性定量结合，使得光电流强度相应降低，从而实现了采用无标记的光电化学方 法检测甲胎蛋白的免疫传感器的构建。
[0006] 本发明采用的技术方案如下： 1. 一种无标记光电化学甲胎蛋白免疫传感器的制备方法，其特征在于，制备步骤为： (OWIT0导电玻璃为工作电极，在电极表面滴涂8?12 uL二氧化铁纳米粒子溶胶Ti〇2 NPs，室温下瞭干后，滴涂8?12 uL金银纳米棒溶胶Au@Ag NRs,并在室温下瞭干； (2)将步骤（1)中得到的电极表面滴涂8?12 uL 0. 01 mol/L的氯把酸溶液HsPclCl" 接着使用高压隶灯照射30?90砂，制得Ti化NPs负载的金银把合金纳米棒材料Au@Ag-Pd NDRs修饰的工作电极，室温下瞭干； (3) 将步骤（2)中得到的电极用超纯水清洗，室温下瞭干后，在电极表面滴涂2?4化戊 二酵溶液GA，4 C冰箱中保存瞭干； (4) 将步骤（3)中得到的电极用超纯水清洗，4 C冰箱中保存瞭干后，在电极表面滴涂 8?12化10 M"g/mL的甲胎蛋白抗体溶液,4 C冰箱中保存赔干； (5) 将步骤（4)中得到的电极用超纯水清洗，4 C冰箱中保存瞭干后，继续在电极表面 滴涂8?12化100嗦/血的牛血清白蛋白BSA溶液，4 °C冰箱中保存瞭干，超纯水清洗，4 °C冰箱中瞭干成膜，制得无标记光电化学甲胎蛋白免疫传感器； 所述的Ti化NPs为Img/mL的二氧化铁纳米粒子水溶液； 所述的Au@Ag NRs为金@银核壳纳米棒水溶液，所述金@银核壳纳米棒是W棒状金纳 米粒子为核、W银纳米粒子为壳层的核壳结构的棒状纳米粒子，所述棒状纳米粒子的长度 为 20?50nm ; 所述的H2PCICI4为抑值为1?2的氯把酸水溶液； 所述的Au@Ag-Pd NDRs为金@银把核壳枝晶状的纳米棒，所述金@银把核壳枝晶状的 纳米棒是W棒状金纳米粒子为核、W枝晶状银把合金纳米粒子为壳层的核壳结构的纳米粒 子，所述纳米棒的长度为20?50nm ; 所述的GA为体积比为2. 5%的戊二酵水溶液。
[0007] 2.本发明所述的一种无标记光电化学甲胎蛋白免疫传感器的制备方法，其特征在 于，所述的Au@Ag Ms制备步骤为： 将20血金纳米棒溶胶Au Ms和20血0. 05?0. 2 mol/L的十六焼基H甲基漠化馈CTAB 溶液混合，在30?45C下揽拌，并顺序加入3?6血0. 1 111〇1/1的心抗坏血酸AA溶液、0. 5?1 血0. 05 mol/L的硝酸银AgN〇3溶液和3?6血0. 1 mol/L的氨氧化轴化0H溶液，停止揽 拌，静置1?化，离也分离，将产品重新分散到20mL水中，得到Au@Ag NRs ; 所述的Au NRs是金纳米棒水溶液，所述金纳米棒是棒状的金纳米粒子，所述金纳米棒 的长度为20?40皿。
[0008] 3.本发明所述的一种无标记光电化学甲胎蛋白免疫传感器的制备方法所制备的 传感器，应用于甲胎蛋白的检测，步骤如下： 1) 将已知浓度的甲胎蛋白抗原标准溶液加入到40?60化、pH=7. 0?8. 0的PBS缓冲溶液 中，制得抗原混合溶液，取5?10化抗原混合溶液滴涂到所制备的无标记光电化学甲胎蛋白 免疫传感器的工作电极上，在4 °C冰箱中保存瞭干，pH=7. 0?8. 0的PBS缓冲溶液清洗后， 4 °C冰箱中保存瞭干； 2) WAg/AgCl电极作为参比电极、笛丝电极作为对电极，与1)中组装的工作电极组 成H电极系统，连接到光电化学检测设备上；在电解槽中先后加入10?25mL抑=7. 0?8. 0的 PBS缓冲溶液和lOmL 0. 1?0. 3 mol/L的AA溶液；采用i-t测试手段，根据所得的光电流值 与甲胎蛋白抗原标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线； 3) 将待测样品溶液代替甲胎蛋白抗原的标准溶液，按照所述甲胎蛋白抗原的工作曲线 的绘制方法进行检测。
[0009] 本发明的有益成果 (1)本发明所述的甲胎蛋白免疫传感器制备简单，操作方便，实现了对样品的快速、灵 敏、高选择性检测，具有市场发展前景； (2)本发明首次采用光电化学方法制备了 Au@Ag-Pd NDRs并将其应用于光电化学免疫 传感器的制备中，通过Ti〇2 NPs与Au@Ag-Pd NDRs的共同作用，显著提高了光生载流子的 有效浓度，大大提高了光电化学传感器的检测灵敏度，具有重要的科学意义和应用价值。
【具体实施方式】
[0010] 实施例1 Au@Ag Ms的制备 将20血金纳米棒溶胶Au Ms和20血0. 05 mol/L的十六焼基H甲基漠化馈CTAB溶 液混合，在3(TC下揽拌，并顺序加入3血0. 1 111〇1/1的心抗坏血酸AA溶液、0. 5血0.05 mol/L的硝酸银AgN〇3溶液和3血0. 1 mol/L的氨氧化轴化0H溶液，停止揽拌，静置比， 离也分离，将产品重新分散到20mL水中，得到Au@Ag NRs ; 所述的Au NRs是金纳米棒水溶液，所述金纳米棒是棒状的金纳米粒子，所述金纳米棒 的长度为20皿。
[0011] 实施例2 Au@Ag Ms的制备 将20血Au Ms和20血0. 1 mol/L的CTAB溶液混合，在40°C下揽拌，并顺序加入5血 0. 1 mol/L 的 AA 溶液、0. 7 ml 0. 05 mol/L 的 AgN〇3溶液和 5 ml 0. 1 mol/L 的化0H 溶液， 停止揽拌，静置化，离也分离，将产品重新分散到20mL水中，得到Au@Ag NRs ; 所述的Au NRs是金纳米棒水溶液，所述金纳米棒是棒状的金纳米粒子，所述金纳米棒 的长度为30皿。
[001引 实施例3 Au@Ag Ms的制备 将20血Au Ms和20血0. 2 mol/L的CTAB溶液混合，在45°C下揽拌，并顺序加入6血 0. 1 mol/L的AA溶液、1血0. 05 mol/L的AgN03溶液和6血0. 1 mol/L的化0H溶液， 停止揽拌，静置化，离也分离，将产品重新分散到20血水中，得到Au@Ag NRs ; 所述的Au NRs是金纳米棒水溶液，所述金纳米棒是棒状的金纳米粒子，所述金纳米棒 的长度为40皿。
[0013] 实施例4无标记光电化学甲胎蛋白免疫传感器的制备方法 (1) 将宽为1cm、长为4cm的IT0导电玻璃作为工作电极，在电极表面滴涂8 uL Img/mL 的二氧化铁纳米粒子溶胶Ti〇2 NPs,室温下瞭干后，滴涂8 uL金银纳米棒溶胶Au@Ag NRs, 并在室温下瞭干； (2) 将步骤（1)中得到的电极表面滴涂8 uL 0.01 mol/L抑值为1的氯把酸溶液 H2PCICI4,接着使用高压隶灯照射30砂，制得Ti化NPs负载的金银把合金纳米棒材料Au@ Ag-Pd NDRs修饰的工作电极，室温下瞭干； (3) 将步骤（2)中得到的电极用超纯水清洗，室温下瞭干后，在电极表面滴涂2化2.5% 的戊二酵溶液GA，4 C冰箱中保存瞭干； (4) 将步骤（3)中得到的电极用超纯水清洗，4 C冰箱中保存瞭干后，在电极表面滴涂 8化10嗦/mL的甲胎蛋白抗体溶液，4 °C冰箱中保存瞭干； (5) 将步骤（4)中得到的电极用超纯水清洗，4 C冰箱中保存瞭干后，继续在电极表面 滴涂8化100嗦/mL的牛血清白蛋白BSA溶液，4 °C冰箱中保存瞭干，超纯水清洗，4 °C 冰箱中瞭干成膜，制得无标记光电化学甲胎蛋白免疫传感器； 所述的Au@Ag