用于动物病原体检测的无害化阳性对照品的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于免疫学检测领域，具体地说，涉及一种用于动物病原体检测的无害化阳性对照品及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002]随着免疫学技术的发展，利用酶联免疫学和化学发光方法对各种兽类血清中所含病原体抗体的检测试剂日益增多，主要有以下两类。第一类为动物免疫后对免疫效果进行评价的检测试剂，如常用的口蹄疫、猪瘟抗体检测试剂、犬和猫的狂犬病毒抗体检测试剂盒等；还有一类为鉴别动物感染病原体的检测试剂，如常用的各类牛、羊、猪的各种病原体感染检测试剂盒。这些试剂盒主要采用双抗原夹心法、间接法或捕获法。
[0003]间接法具体操作是将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。加稀释的受检血清，保温反应。血清中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，血清中的其他成份在洗涤过程中被洗去。加酶标抗抗体，使固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关。最后加入底物显色。
[0004]双抗原夹心法是指利用酶联免疫吸附法、化学发光法或磁微粒酶免疫技术等基于抗原抗体反应原理，以特定病原体的特异性抗体为检测目标，通过包被和标记该病原体的特异性抗原来对血清或血浆样本中病原体特异性抗体进行体外检测的试剂。
[0005]捕获法是指利用酶联免疫吸附法、化学发光法或磁微粒酶免疫技术等基于抗原抗体反应原理，以特定病原体的特异性IgM抗体为检测目标，通过包被抗IgM抗体来对血清或血浆样本中病原体特异性IgM抗体进行体外检测的试剂。
[0006]以上三种方法所采用的阳性对照往往是该检测试剂所测物种该类抗原阳性的血清加工后获得的，有些病原体血清属于高风险并且不易获取，即使经过灭活也有潜在生物危害，因此获取稳定、安全的阳性对照将很大程度提升试剂的安全性。
【发明内容】
[0007]为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种用于动物病原体检测的无害化阳性对照品及其制备方法与应用。
[0008]为了实现本发明目的，本发明首先提供一种用于检测病原体的无害化阳性对照品，由包被物和标记物的抗体及抗该抗体的二抗按照1:1:1-8的摩尔比混合制成。
[0009]所述包被抗原为待检测病原体抗原。
[0010]所述包被物和标记物的抗体及抗该抗体的二抗利用免疫学方法制备得到。
[0011]本发明所述阳性对照品的制备方法包括如下步骤:
[0012](I)制备包被物抗体和标记物的抗体；
[0013](2)制备二抗；
[0014](3)阳性对照的获得:将包被物抗体和标记物的抗体以及二抗混合并加入小牛血清和硫柳汞后用生理盐水稀释作为阳性对照
[0015]上述方法中，步骤(3)包被物抗体、标记物抗体以及二抗按照1:1:1-8的摩尔比混入口 ο
[0016]进一步地，步骤(3)中按照与抗体混合液的体积比10:1小牛血清，按照与抗体混合液的体积比2:1加入10%的硫柳汞后，用生理盐水稀释至总体积为抗体混合液的体积的200倍后作为阳性对照。
[0017]优选地，本发明所述包被物抗体和标记物的抗体为单抗；所述二抗为多抗。
[0018]含有本发明阳性对照品的动物病原体检测试剂盒也属于本发明的保护范围。
[0019]进一步地，所述检测试剂盒为ELISA检测试剂盒。
[0020]本发明还提供了上述阳性对照品在无害化检测动物病原体中的应用。阳性对照品的浓度为0.05-20mg/mlo优选地，阳性对照品的浓度为0.5mg/ml。
[0021]本发明所采用的包被物和标记物的单抗或多抗特点如下:可与包被物和标记物反应的基因表达、化学修饰、免疫学方法获得的抗体。
[0022]本发明所采用的包被物和标记物的单抗或多抗的二抗特征如下:可与包被物和标记物的单抗或多抗反应的基因表达、化学修饰、免疫学方法获得的抗体。
[0023]本发明的有益效果在于:利用免疫学方法制备包被物和标记物单抗或多抗和制备它们的二抗，按照1:1:1-8的摩尔比混合，添加其他辅料稀释后作为阳性对照，解决阳性对照材料的来源受限并避免使用含有动物病原的血清作为阳性对照的潜在风险。本发明采用严格检验的实验动物进行抗体制备从源头上保障了生物安全性，这些来源与实验动物的抗体制成的阳性对照不存在生物危害风险，同时，和从病毒感染者身体内采集相比较来源更广泛，抗体效价更高，完全可以满足试剂盒中作为阳性对照的需要。
【具体实施方式】
[0024]以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0025]若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0026]实施例1无害化阳性对照品的制备
[0027]通过利用免疫学方法制备鼠抗包被物和标记物单抗，并制备兔抗鼠多抗，按照包被物单抗:标记物单抗:多抗比为1:1:1加入混合在一起作为阳性对照，解决阳性对照材料的来源并避免使用阳性血清潜在的风险。
[0028]1、鼠抗包被物和标记物单抗的获得:以包被物和标记物作为免疫抗原，免疫BALB/c小鼠，将免疫小鼠的脾脏淋巴细胞与骨髓瘤细胞相融合，然后用有限稀释方法获得可分泌红细胞单抗的杂交瘤。具体步骤如下:
[0029]取0.2mg/ml的包被物和标记物，初次免疫采用皮下多点注射，0.1ml/点，共四点。2周后第二次免疫，剂量同上，腹腔注射。再2周后第三次免疫，剂量同上，腹腔注射(5?7天后采血测其效价)。再过2?3周后加强免疫，剂量0.5ml，腹腔注射。最后一次加强免疫，剂量0.5ml，腹腔注射，3天后小鼠拉颈处死，无菌取脾脏，培养液洗一次，将脾脏研碎，过不锈钢筛网，离心，细胞用培养液洗2次，计数，取I X 17脾淋巴细胞悬液备用，准备融合。
[0030]将6?10周大的BALB/C小鼠拉颈处死，浸泡在75%酒精内，3?5min，用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜，用无菌注射器注入5?6ml预冷的培养液(严禁刺破肠管)反复冲洗，吸出冲洗液放入1ml离心管，1200rpm/分离5?6min，用20%小牛血清(NCS)的培养液混悬，调整细胞数至I X 107/ml，加入96孔板，100 μ I/孔放入37°C CO2孵箱培养，制得饲养细胞。
[0031]将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10或1:5的比例混合在一起，在50ml离心管中用无血清不完全培养液洗I次，离心，1200rpm, 8min ;弃上清，用吸管吸净残留液体，以免影响聚乙二醇(PEG)浓度。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。90s内加入37°C预温的lml45%PEG (分子量4000)溶液，边加边轻微摇动，37°C水浴作用90s，加37°C预温的不完全培养液以终止PEG作用，每隔2min分别加入lml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml，离心，800rpm, 6min。弃上清，用含20%小牛血清HAT选择培养液重悬细胞。将上述细胞加到已有饲养细胞层的96孔板内，每孔加ΙΟΟμΙ。一般一个免疫脾脏可接种4块96孔板。将培养板置37°C、5% CO2培养箱中培养，完成融合。
[0032]在用HAT选择培养I?2天内，将有大量瘤细胞死亡，3?4天后瘤细胞消失，杂交细胞形成小集落，HAT选择培养液维持7?10天后应换用HT培养液，再维持2周，改用一般培养液。在上述选择培养期间，杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时，即可用筛选出所需要的杂交瘤细胞