一种3-甲基喹噁啉-2羧酸免疫亲和柱及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于兽药残留分析技术领域，具体涉及一种3-甲基喹噁啉-2羧酸免疫亲和柱及其制备方法。
【背景技术】
[0002]喹噁啉类作为养殖动物的药物添加剂，具有抗菌和促生长作用，且价格低廉，被广泛应用于生产之中。代谢研宄表明，喹乙醇在动物体内迅速生成脱一氧和脱二氧产物等产物，可转化为3-甲基喹噁啉-2羧酸。3-甲基喹噁啉-2羧酸在动物体内消除最慢，被规定为喹乙醇的残留标示物。毒理学研宄表明，喹乙醇有致癌、致畸等毒性，欧盟于1998年禁止其使用。中国允许喹乙醇用作育成猪饲料添加剂，规定肌肉和肝脏组织中3-甲基喹噁啉-2羧酸的最大残留限量为4 μ g/kg和50 μ g/kg。因此，建立简便、灵敏、符合国际最新规定的喹噁啉类残留分析方法十分必要。现有的检测3-甲基喹噁啉-2羧酸的方法主要是仪器分析，包括高效液相色谱法、液质联用(HPLC-MS)、气质联用(GC-MS)等。但要想使这些检测方法能达到理想的检测效果，则需将样品进行不同程度的前处理，因此实现具有快速、简便优点的样品前处理方法具有现实意义。目前样品前处理方法主要液液萃取方法和常规的固相萃取净化方法，都在不同程度地存在着处理过程繁琐、净化效果差、有机溶剂浪费多、所需时间长等缺点。免疫亲和色谱(IAC)是一种将免疫反应与色谱分析方法相结合的分析方法。它的高度选择性和高亲和性无疑使分析过程简化。但用免疫亲和柱净化基质中的3-甲基喹噁啉-2羧酸未见报道。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种3-甲基喹噁啉-2羧酸免疫亲和柱及其制备方法，为了克服现有样品前处理技术的缺陷，提供一种快速、简便的样品前处理方法。
[0004]一种3-甲基喹噁啉-2羧酸免疫亲和柱的制备方法，该方法的具体步骤为:
[0005](I)基质制备:用适量溴化氰活化的琼脂糖干粉Sepharose4B用ImM盐酸使其溶胀，然后抽滤，使用I mM HCl洗涤；
[0006](2)偶联:预先将纯化好的由保藏号为CCTCC NO:C201147的杂交瘤细胞MQCAGA/5B10分泌的3-甲基喹噁啉-2羧酸单克隆抗体置于0.1M NaHCO3 (pH 8.3)偶联缓冲液中透析，使用0.1M NaHCO3 (pH 8.3)的偶联缓冲液洗涤溶涨后的经CNBr活化的Sepharose4B，洗涤后，迅速将CNBr活化的S印harose 4B转移到抗体溶液中，混匀，室温下震荡充分反应4h ;用5倍体积以上的偶联缓冲液洗去未偶联的3-甲基喹噁啉-2羧酸单克隆抗体，得到琼脂糖-单抗偶联复合物；
[0007](3)封闭活性基团:将琼脂糖-单抗偶联复合物转入0.1M Tris-HCl缓冲液中，4°C静止16h ；
[0008](4)洗涤:将步骤(3)得到的琼脂糖-单抗偶联复合物用5倍载体体积的pH4.0的含0.5MNaCl的0.1M醋酸缓冲液和5倍载体体积的pH8.0的含0.5M NaCl的0.1M Tris-HCl缓冲液各淋洗一次，此洗涤过程重复三次；
[0009](5)装柱:采用湿法装柱，将步骤(4)得到的琼脂糖-单抗偶联复合物填充入固相萃取空柱管中，用5倍柱床体积的无菌过滤的0.01% NaN3-PBS过柱，并使用0.01%NaN3-PBS保存，即制成3-甲基喹噁啉-2羧酸免疫亲和柱；
[0010](6)柱子再生:先用0.1M醋酸-醋酸钠，内含0.5M NaCl (pH 4.0)缓冲液洗涤，接着再用0.1M Tris-HCl (pH8.0，内含0.5M NaCl)缓冲液进行洗涤，洗涤至少3个循环。
[0011]本发明的免疫亲和柱能与3-甲基喹噁啉-2羧酸特异性结合，最大结合容量为240ngDMT。该免疫亲和柱主要用于动物性产品中的3-甲基喹噁啉-2羧酸的纯化，以便后期对样本中3-甲基喹噁啉-2羧酸含量进行高效液相色谱检测。
【附图说明】
[0012]图1:3-甲基喹噁啉-2羧酸标准溶液(40 μ g/L)液相色谱图。
[0013]图2:猪肌肉中添加3-甲基喹噁啉-2羧酸(4 μ g/kg)液相色谱图。
[0014]图3:猪肝脏中添加3-甲基喹噁啉-2羧酸(20 μ g/kg)液相色谱图。
【具体实施方式】
[0015]实施例1: 一种3-甲基喹噁啉-2羧酸免疫亲和柱及其制备方法
[0016]一种检测3-甲基喹噁啉-2羧酸的免疫亲和柱，由空柱管和凝胶组成，凝胶上偶联了 3-甲基喹噁啉-2羧酸的单克隆抗体。该免疫亲和柱按以下步骤制备:
[0017](I)基质制备:将用适量溴化氰活化的琼脂糖干粉Sepharose4B用ImM盐酸使其溶胀，然后抽滤，使用I mM HCl洗涤。
[0018](2)偶联:预先将纯化好的3-甲基喹噁啉-2羧酸单克隆抗体(分泌3-甲基喹噁啉-2羧酸的单克隆抗体的杂交瘤细胞MQCA GA/5B10，于2011年6月29日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC N0:C201147。本发明的杂交瘤细胞MQCA GA/5B10的制备参照章谷生等.单克隆抗体在医学上的应用[M].上海科学技术出版社，1987 ;或参考华中农业大学授权专利，专利号201110036167X“一种甲型Hl亚型流感病毒双抗体夹心ELISA试剂盒及应用”公开的方法，或者参考华中农业大学授权专利，专利号2013102142017 “抗伏马菌素BI的单克隆重组抗体H7”报道的方法(其中包括缓冲液的制备))置于0.1M NaHCO3 pH 8.3偶联缓冲液中透析。使用0.1M NaHCO3 pH 8.3偶联缓冲液洗涤溶涨后的经CNBr活化的Sepharose 4B，洗涤后，迅速将CNBr活化的Sepharose4B转移到抗体溶液中，混匀，室温下震荡充分反应4h。用5倍体积以上的偶联缓冲液洗去未偶联的3-甲基喹噁啉-2羧酸单克隆抗体，得到琼脂糖-单抗偶联复合物。
[0019](3)封闭活性基团:将琼脂糖-单抗偶联复合物转入0.1M Tris-HCl缓冲液中，4°C静止16h，得到琼脂糖-单抗偶联复合物。
[0020](4)洗涤:将步骤(3)得到的琼脂糖-单抗偶联复合物用5倍载体体积的pH4.0的含0.5MNaCl的0.1M醋酸缓冲液和5倍载体体积的pH8.0的含0.5M NaCl的0.1M Tris-HCl缓冲液各淋洗一次，重复此洗涤过程三次，得到进一步处理的琼脂糖-单抗偶联复合物。
[0021](5)装柱:采用湿法装柱，将步骤(4)所得的琼脂糖-单抗偶联复合物填充入固相萃取空柱管中，用5倍柱床体积的无菌过滤的0.01% NaN3-PBS(磷酸盐