膀胱癌检测组合物、试剂盒及相关的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及检测癌症的组合物、试剂盒和方法，特别地涉及用于检测膀脫癌的该 种组合物、试剂盒和方法，且更特别地涉及用于无创地检测膀脫癌的该种组合物、试剂盒和 方法。此外，该种组合物、试剂盒和方法在使用免疫组织化学程序的情况下可用作辅助细胞 学评价。
【背景技术】
[0002] 膀脫癌是全世界五种最常见的恶性肿瘤之一。2010年仅在美国的膀脫癌病例预 计为 67, 160 例，预计死亡 13, 750 例（A. Jemal 等，Cancer Statistics, 2010CA:A Cancer Journal for Clinicians 60, 277-300, 2010)。当早期检查到时，5年内的存活率大约为 94% ;因此及时的介入可W显著提高患者存活的概率。目前，超过80%的膀脫肿瘤是非浸 润性的乳头瘤（pTa或pTl)，但是剩余部分在诊断期间展现出肌肉浸润并具有更不太有利 的预后。
[0003] 尽管肌肉浸润性疾病需要根治性手术，非肌肉浸润性肿瘤在有或没有膀脫灌注 疗法的情况下，通过经尿道切除肿瘤可W更保守地治疗；然而，70% W上的患有早期阶段 疾病的患者会在诊断后的前两年有复发，该使得膀脫癌成为最常见的癌症之一。如果不 及时治疗，该些最初非浸润性病变可演变为肌肉浸润性病变化Millan-Ro化iguez等，J. 化〇1. 164, 680-84, 2000)。膀脫癌的复发现象意味着患者需要至少每年一次的严格监控。为 了生命的质量和积极的临床结果，及时发现疾病复发和初步诊断同样重要。
[0004] 目前的主要诊断方法是膀脫镜检查结合尿脱落细胞学检查（VUC)。膀脫镜检 查是不舒服的侵入性操作且成本高，并可能造成感染和创伤。VUC仍然是用于非侵入性 检查膀脫癌的可选择方法；然而，尽管试验具有良好的特异性，但灵敏度是次优的，尤其 是对于低级和低阶段肿瘤值.S. Kaufman 等，Lancet 374, 239-49, 2009 ;D.Trivedi and E. M. Messing, BMC Urol. 9, 13, 2009)。
[0005] 许多用于尿分析的诊断蛋白标志物已被商业开发，但单一的生物标志物的试验缺 乏足够的能量来替代VUC或减少重复膀脫镜检查的需求。考虑到信号通路的兀余，分子网 络之间的串扰和肿瘤的寡克隆性，该不奇怪。本发明的实施方案提供了用于检测非侵入性 所得材料中的膀脫癌的可选生物标志物的鉴定，该提供了理想的全基因组分析策略。 发明概要
[0006] 通过举例的方式提供了用于诊断膀脫癌的组合物和方法。该方法可包括检测至少 两种在体样品中结合的生物标志物的过度表达，例如，尿液样品，众所周知，其中含有源于 包括尿路上皮的膀脫粘膜的基因和基因产物。该方法能把患有膀脫癌的受试者得到的生 物样品与未患有癌症（例如膀脫癌）的受试者获得的样品区分出来。在一个实施方式中， 该方法包括生物标志物的预选组合的检测，所述生物标志物在疾病状态下选择性地过度表 达，而不是在正常组织中。
[0007] 该方法也可与其它有创或无创的诊断技术结合使用，该些技术目前在本领域已知 或将在未来研发。
[000引生物标志物的过度表达可W在蛋白质或核酸水平上评估。在一些实施方式中，提 供了用于实施本发明方法的试剂W及包含该些试剂的试剂盒。
[0009] 本发明的教导基于当前发明者先前的实验进行改进，展示出分析尿脱落基因 表达分析的可行性W鉴定膀脫癌相关的基因标签（C.J. Rosser等，Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 18(2), 444-53, Feb. 2009)。该里，发现分析阶段扩大到92例，选取的候 选生物标志物分别在两套独立的81个和127个尿液样品中进行验证。尿路上皮细胞mRNA 的线性扩增能够分析最小样品中47, 000个W上的转录，且统计分析确定了与膀脫癌相关 的差异表达的一组52个基因（P<0. 001)。
[0010] 在验证阶段，使用定量PCR或化ISA策略对自然排出的尿液样本中获得的尿路上 皮细胞监测选定的44个祀转录。许多单个的基因/蛋白质显示出有希望作为膀脫癌检测 的生物标志物，W及作为多个基因/蛋白质的生物标志物成员（panel)，例如，示例性的9个 和14个成员的组合物和试剂盒，实现了非常高的鉴别能力。该些生物标志物可W纳入可靠 的尿分析试验设计，从而导致用于膀脫癌检测和高危患者监测的可靠、精确、无创的测试。
[0011] 本发明的一个实施方式包括用于检测受试者泌尿生殖器相关癌症（包括膀脫 癌）的方法，该方法包括确定受试者的生物样品中的一个或多个生物标志物的存在或存 在水平，其中生物标志物选自：比-8、MMP9、SDC1、(XL18、SERPI肥1、CD44、VEGF-A、CA9和 ANG，其中生物标志物的存在和/或存在水平指示出受试者中癌症的存在与否。本发明 的另一个实施方式包括检测表2至表10中列举的一个或多个生物标志物，且生物标志 物选自；UBC ;PPIA ;PGK1 ;GAP畑；BIRC5 ;TERT ;KRT20 ;CLU ;PLAU ;CALR ;ANG ;CA9 ;SCG3 ; ATF3 ;TLR2 ;AGT ;DMBT1 ;ERBB2 ;CTNNA1 ;ATM ;FBX09 ;CCNE2 ;NUSAP1 ;SMI2 ;化孤2 ;MMP12 ; ILIRAP ;ITGB日；DSC2 ;AP0E ;TMEM45A ;SYNGR1 ;MMP10 ;IL8 ;VEGFA ;CPA1 ;CCL18 ;CRH ; MCOLNl沈RPI肥IMMPl ;MMP9 ;FGF22 ;MXRA8 ;NRG3 ;沈MA3D ;PTX3 和 RABIA。本发明的另一个 实施方式包括检测表4至表10中列举的一个或多个生物标记物。本发明的另一个实施方 式包括检测如尿液中存在的蛋白质或mRNA转录或尿液中存在的尿路上皮细胞的生物标志 物成员。
[0012] 在一实施方式中，本发明包括检测尿液中存在的一个或多个生物标志物的水平 (例如，蛋白质或mRNA转录的水平）或尿液中存在的尿路上皮细胞，其中生物标志物选自 CCL18、CD44、VEGF-A。在一实施方式中，本发明包括检测尿液中存在的一个或多个生物标志 物的水平（例如，蛋白质或mRNA转录的水平）或尿液中存在的尿路上皮细胞，其中生物标 志物选自 CA9、(XL18、MMP12、TMEM45A、MMP9、SEMA3D、ERBB2、CRH 和 MXRA8。
【附图说明】
[0013] 参照附图对本发明的实施方式进行例示说明，其中：
[0014] 图1A是说明膀脫癌的14基因分类诊断准确率的受试者工作特征（R0C)曲线；
[0015] 图1B是癌症和非癌症组的14基因标签的表达分布；
[0016] 图1C显示了 P值和受试者工作特征曲线下的面积值（AUC)作为预测模型包含的 基因数目函数的变化图；
[0017] 图2A是例示膀脫癌的9基因分类诊断准确率的ROC曲线，其仅包括上调 (up-regulated)的基因；
[0018] 图2B是癌症和非癌症组的9基因标签的表达分布；
[0019] 图2C显示了 P值和AUC值相对于预测模型包含的基因数目的变化图；
[0020] 图3是用于推导最佳基因生物标志物标签的示例性"留一法交叉验证"(L00CV)流 程图；
[002。 图4是16个内源对照的应用生物系统微流体卡片化qMan? (Micro Fluidic Card化qMan液）的低密度阵列（TLDA)分析图；
[0022] 图5是膀脫癌的检测方法的实施方式流程图；
[0023] 图6是确定患者预后方法的流程图；
[0024] 图7是癌症检测方法的流程图。
【具体实施方式】
[00巧]下面将参照附图对本发明进行更充分地说明，其中本发明的实施方式通过说明和 举例的方式展示。然而，本发明可W体现为多种形式，且不应解释为限于在此阐述的实施方 式。相反，提供该些实施方式用来使本发明的公开更彻底和完整，且将本发明的范围充分地 传达给本领域的技术人员。美国专利申请公开号US2010/0184049 A1在此W引证的方式并 入本文。
[0026] 在一实施方式中，本发明提供了用于诊断泌尿生殖器相关癌症（包括膀脫癌）的 方法，其中该方法包括：
[0027] 确定生物样品中的一个或多个生物标志物的存在或存在水平，其中生物标志物选 自CA9 (碳酸酢酶I幻，MMP9 (基质金属蛋白酶9)，MMP10 (基质金属蛋白酶10)，PAI-1 (纤溶 酶原激活物抑制剂-1，也称丝氨酸蛋白酶抑制剂E1)，ANG (血管生成素），VEGF (血管内皮生 长因子），SYNDECAN (多配体聚糖），A1AT ( a -1抗膜蛋白酶原），IL-8 (白介素8)，AP0E (载 脂蛋白巧和CD44 ;
[0028] 其中与对照组相比，所述的一个或多个生物标志物的存在或所述的一个或多个生 物标志物升高水平，表明了受试者具有泌尿生殖器相关的癌症（包括膀脫癌）。
[0029] 在一实施方式中，本发明用于膀脫癌的诊断。
[0030] 在一实施方式中，生物样品是尿液样品。在某些实施方式中，生物样品包括膀脫组 织和/或尿路上皮细胞中的活组织检查。
[0031] 在一实施方式中，生物样品来自受试者人。
[0032] 生物标志物的存在或存在水平可W在核酸（如mRNA)和/或蛋白水平检测。
[0033] 在一实施方式中，对照物是未患有癌症的受试者所得样品中存在的生物标志物水 平。在一实施方式中，对照物是未患有膀脫癌或其他癌症的受试者所得样品中存在的生物 标志物水平。在一实施方式中，对照物是具有良性膀脫肿瘤但不患有膀脫癌的受试者所得 样品中存在的生物标志物的水平。
[0034] 在一实施方式中，表2至表10 (具体是表4至表10)中列举的一个生物标志物或 生物标志物的组合的存在或存在水平可用于泌尿生殖器相关癌症（如膀脫癌）的诊断。
[0035] 本发明还提供了用于膀脫癌诊断的试剂盒，其包括检测膀脫癌的一个或多个生物 标志物的试剂。能够检测受试者生物样品中的生物标志物的试剂是与编码生物标志物的 生物标志物多肤或核酸分子相互作用或结合的那些试剂。该些试剂（在此也称为结合剂） 的实例包括，但不限于，与蛋白质/多肤生物标志物结合的抗体，适体或其片段，蛋白质/多 肤生物标志