植物病原菌活性评价和杀菌剂高通量筛选方法及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基于双重荧光染色的植物病原菌活性评价和杀菌剂高通量筛选 方法及试剂盒，该方法及试剂盒可在病原菌活性评价、杀菌剂筛选、食品安全评价、水质评 价等方面应用，属于植物保护和生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 植物病原菌是植物病害发生和流行的一个重要因子，全世界每年因病害导致的损 失数以亿元计。快速、准确地检测植物病原菌及其活性，是对病情进行有效预测的基础。
[0003] 目前，植物病原菌的检测主要采用常规病原菌分离培养技术，该方法费时、费力， 且不能检测专性寄生菌。后来发展起来的免疫学技术和分子生物学方法，如PCR等，这类方 法能准确、灵敏、快速地对植物病原菌进行定性及定量检测，但是不能检测其活性。然而，植 物病原菌的活性评价，是对病害进行准确预测预报的基础。国内外关于植物病原菌活性检 测分析的研究较少，主要采用传统的孢子萌发计数法（Colony Forming Units, CFU)，该方 法虽然对活性的检测准确、可靠，但检测时间较长。
[0004] 荧光染色法是医学上检测细胞凋亡和细胞坏死的重要手段。细胞凋亡或坏死后， 会发生细胞体积变化、细胞膜通透性改变、核DNA降解等变化，根据这些特征，选择适合的 荧光染料，可以准确检测细胞状态。植物病原菌细胞凋亡的表型和生理特征与动物细胞相 似，而且细胞结构和代谢过程简单。目前，荧光染色法在病原菌研究方面有少数报道，利用 坏死细胞的特异性荧光染料碘化丙啶检测大豆猝死综合病菌的活性，SYTOX Green用于检 测环境及水中的人类致病菌大肠杆菌和沙门氏菌的活性。
[0005] 高通量筛选（High throughput screening,HTS)技术是发现创新药物的重要技术 手段之一，已成为制药和生物技术研究中的重要工具。现代农业对于杀菌剂的依赖越来越 强，随着环境和消费安全的呼声日益提高，以及有害生物抗药性的产生使杀菌剂使用寿命 缩短。新农药的创制与开发越来越迫切，也越来越困难。据统计，一个高效、低毒、环境友好 型新农药的成功开发，需要合成筛选8万个化合物，耗资上亿元。这对新型杀菌剂的合成和 筛选都提出了新的挑战。目前，我国多采用孢子萌发法和菌丝生长速率法进行杀菌剂的筛 选，而随着新型杀菌剂创制技术的快速发展，要求建立一种简单、快速的筛选新化合物的方 法。
[0006] 通过对植物病原菌活性评价和杀菌剂筛选的现有技术分析可以看出，现有技术费 时、费力、而且成本较高或需要昂贵的仪器设备，急需一种简单易行、成本低廉、不需昂贵仪 器设备就能进行快速定量植物病原菌活性评价的新方法。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是针对目前植物病原菌活性检测和杀菌剂筛选费工、费时，检测结 果不稳定、费用高等问题，提供一种基于双重荧光染色的植物病原菌活性评价和杀菌剂高 通量筛选方法及试剂盒，通过检测病原菌有活力和无活力孢子或菌丝细胞的荧光信号，确 定病原菌活性，实现杀菌剂的药效评价和高通量筛选。该方法及试剂盒具有操作简单易行、 检测时间短、检测量大、成本低廉、可同时评价多种杀菌剂的药效等特点，可以广泛应用于 杀菌剂筛选、毒性评价、食品安全评价、水质评价等领域。具体内容如下： 1、一种基于双重荧光染色的植物病原菌活性评价和杀菌剂高通量筛选方法 本发明公开一种植物病原菌活性评价和杀菌剂高通量筛选方法，以微量滴定板作为工 具载体，采用两种不同的荧光染料，分别对植物病原菌有活力和无活力的孢子或菌丝细胞 进行荧光标记，由于有活力与无活力孢子或菌丝细胞着色不同，利用荧光显微镜或流式细 胞仪检测荧光信号，并统计病原菌存活率，可直接反映植物病原菌的活性，实现杀菌剂药效 评价及高通量筛选。
[0008] 该方法应用的第一种荧光染料可使有活力孢子或菌丝细胞着色产生特定荧光， 选自吖啶橙（A0)、荧光素二醋酸醋（FDA)、Hoechst 33258、4'，6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI)、Annexin V-FITC等中的一种，但不限于此；第二种荧光染料可使死孢子或菌丝细胞 着色产生特定荧光，选自碘化丙啶（PI )、溴化乙啶（EB )、SYTOX等中的一种，但不限于此。
[0009] 其中，第一种荧光染料AO的工作浓度为10-1000 Pg/mL，488 nm蓝色光激发下， 使活细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光；FDA的工作浓度为100-1000 Pg/mL，488 nm蓝色光 激发下，在活细胞中产生绿色荧光；Hoechst 33258的工作浓度为1-100 Pg/mL，350 nm紫 外光激发下，活细胞发出蓝色荧光；DAPI的工作浓度为5-500 Pg/mL，358 nm紫外光照射 时，活细胞发出亮蓝色荧光；Annexin V-FITC的工作浓度为5-500 Pg/mL，480nm蓝色光激 发下，活细胞发出绿色荧光；第二种荧光染料PI的工作浓度为5-1000 Pg/mL，358 nm紫外 光激发下，使死细胞产生红色荧光；EB工作浓度为10-1000 Pg/mL，使死细胞产生桔黄色荧 光；SYTOX的工作浓度为0. l-lPg/mL，使坏死细胞发绿色荧光。
[0010] 其中，第一种荧光染料AO的染色时间为避光处理10-25 min，FDA的染色时间为 5-40 min，Hoechst 33258 的染色时间为 15-50 min，DAPI 的染色时间为 3-15 min，Annexin V-FITC的染色时间为避光处理15-40 min ;第二种荧光染料PI的染色时间为避光处理4-30 min，EB的染色时间为20-40 min，SYTOX的染色时间为5-20 min。
[0011] 该方法中植物病原菌是人工纯培养获得，或者是从病害组织中富集获得。植物病 原菌活性评价的检测对象包括，植物病原真菌的菌丝细胞或孢子，植物病原细菌的孢子，芸 薹根肿菌的休眠孢子。
[0012] 将植物病原菌孢子或菌丝悬浮液，等量加入含多个孔的微量滴定板中，每孔孢子 数量为KTlO 5个。按次序分别加入两种荧光染料，染色温度为4-35°C。最后，采用流式细 胞仪、荧光显微镜或荧光光谱仪检测荧光信号，对植物病原菌活性进行定量评价。
[0013] 该方法可广泛应用于新型化合物筛选、杀菌剂筛选、食品安全评价及水质评价等 领域。
[0014] 2、一种基于双重荧光染色的植物病原菌活性评价和杀菌剂高通量筛选试剂盒 利用本发明可制备成一种快速、定量评价植物病原菌活性和杀菌剂高通量筛选的试剂 盒，该试剂盒含有一个或多个含多个孔的微量滴定板，两种荧光染料，第一种荧光染料使有 活力植物病原菌孢子或菌丝细胞着色，第二种荧光染料使无活力植物病原菌孢子或菌丝细 胞着色。
[0015] 其中，一个或多个含多个孔的微量滴定板，从12孔、24孔、96孔、384孔、1536孔微 量滴定板中进行选择，其中以96孔板和384孔板最佳。微量滴定板每孔包含1个或多个 植物病原菌孢子或菌丝，其中对于96孔板，每孔IO3-IO5个孢子最佳；对于384孔板，每孔 IO2-IO3个孢子最佳。
[0016] 该试剂盒含有的第一种荧光染料选自吖啶橙(A0)、荧光素二醋酸醋（FDA)、 Hoechst 33258、4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI)等中的一种，但不限于此，可使有活力孢 子或菌丝细胞产生特定荧光；第二种荧光染料选自碘化丙啶（PI )、溴化乙啶（EB)、SYTOX等 中的一种，但不限于此，可使死孢子或菌丝细胞产生特定荧光。
[0017] 该试剂盒还可以包括一种或多种植物病原菌，及该病原菌的培养介质与清洗介 质，该介质可以是冻干形式或液体形式。
[0018] 该试剂盒还可以包括杀菌剂高通量筛选说明书，或者化合物或其他方法处理植物 病原菌的说明书。
[0019] 该试剂盒还可以包括防治某种特定病原菌的对照药剂。
[0020] 3、在此项技术中，还有许多有效的生物染色剂可用。不同的染色剂在病原菌细胞 或组织的不同部位反应或集中，并且可以使用这些特性来揭露特定部分区域。可用的生 物染色剂包括，Hoest 33342、胭脂红（Carmine)、考马斯亮蓝（Coomassie blue)、结晶紫、 DAPI、伊红、溴化乙锭、品红、苏木色精（Haematoxulin)、碘、孔雀石绿、甲基氯、亚甲基蓝、中 性红、尼罗红、四氧化锇、罗丹明和沙黄（Safranin)等。
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