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[0042] 2、实验方法
[0043] 2. 1分析方法
[0044] 2. I. 1色谱条件
[0045] 色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18(150X 2. lmm, 5. 0 μ m)。流动相：乙臆：0· 1 % 甲 酸水溶液（35:65)，等度洗脱3.511^11。进样量：1(^1;柱温 ：401：;流速：0.221111/1^11。
[0046] 2. 1. 2质谱条件
[0047] 辅助气化电喷雾离子源（ESI);多反应离子监测（MRM)模式负离子检测，监测 离子对分别为：m/z 883. 4 - 675. 2 (朝藿定 A)，m/z 853. 5 - 645. 3 (朝藿定 B)，m/z 867. 4 - 659. 4 (朝藿定 C)，m/z 721. 3 - 513. 2 (淫羊藿苷），m/z 579. 2 - 271. 1 (柚皮 苷），辅助气化气流量：7500CC/min，雾化气流量：8L/min，气帘气流量：6L/min，离子源喷雾 电压：-4000V，离子源雾化温度：350°C。
[0048] 2. 2工作溶液的配制
[0049] 2. 2. 1系列浓度混合对照品溶液的配制
[0050] 取4个黄酮对照品各约5mg，精密称定，分别置于5ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至 刻度，配制成4种对照品储备液。分别精密量取4种黄酮对照品储备液适量，置IOml量瓶 中，加入甲醇稀释至刻度，摇匀，得混合对照品储备液。2. 2. 2内标溶液的配制
[0051] 取柚皮苷对照品约l〇mg，精密称定，置于IOml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度， 配制成内标储备液。精密量取内标储备液适量，置IOml量瓶中，加入乙腈：0. 1%甲酸水溶 液（35:65)稀释至刻度，摇匀，得100 μ g/ml内标次级储备溶液。精密吸取内标次级储备液 200 μ 1，置IOml量瓶中，加乙腈：0. 1 %甲酸水溶液（35:65)稀释至刻度，摇匀，得到内标工 作液（2 μ g/ml)。2. 2. 3供试品溶液的制备
[0052] 用乙腈：0. 1 %甲酸水溶液（35:65)稀释喘可治注射液2000倍，精密量取1000 μ 1 加内标工作液200 μ 1，涡旋40s，过0. 22 μ m滤膜，取续滤液，得供试品溶液。
[0053] 2. 2. 4标准曲线和质控样品的制备
[0054] 取4种黄酮的标准品储备液，根据各自具体浓度取精确的体积置于同一个IOml量 瓶中，加乙腈：0. 1 %甲酸水溶液（35:65)至刻度，配制成4种黄酮均为1000ng/ml的混合标 准品溶液。然后再按照下示流程逐级稀释，配制800, 300, 100, 30, 10, 3, lng/ml。
[0055]
【主权项】
1. 一种喘可治注射液黄酮类有效成分检测方法，其特征在于，包括如下步骤： 1) 对照品溶液的制备：取对照品朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷，用甲醇或流 动相溶解即得； 2) 内标溶液的制备：取柚皮苷对照品，用甲醇或流动相溶解即得； 3) 供试品溶液的制备：取喘可治注射液用甲醇或流动相稀释即得； 4) 检测方法：液相色谱质谱联用，所述的高效液相色谱条件，色谱柱C18、流动相：乙 腈-酸水溶液；所述的质谱条件，辅助气化电喷雾离子源ESI、多反应离子监测MRM模式负 离子检测。
2. 如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（1)中所述的对照品朝藿定A、朝 藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷分别配置成lmg/ml的对照品贮备液；再分别精密量取对照品 储备液置于同一量瓶中，加入甲醇稀释配制成朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷均为 1000ng/ml的混合对照品储备液。
3. 如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤（2)中所述的柚皮苷对照品配制 成lmg/ml的内标备液，通过稀释步骤配制成2 μ g/ml内标溶液。
4. 如权利要求3所述的检测方法，其特征在于：所述的稀释步骤是指取内标储备液置 于量瓶中，加入甲醇或流动相配制成lOOug/ml内标次级储备溶液，精密吸取内标次级储 备液置于量瓶中，加入甲醇或流动相配制成2 μ g/ml内标溶液。
5. 如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤（3)用流动相稀释喘可治注射液， 精密量取1000-2000 μ 1并加入1/5倍内标溶液混合均匀，滤膜，取续滤液，得供试品溶液。
6. 如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述的流动相是乙腈-0. 1~1 %酸水 溶液，所述的酸为甲酸或乙酸。
7. 如权利要求6所述的检测方法，其特征在于：所述的流动相是乙腈-0. 1 %甲酸水溶 液。
8. 如要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤（4)中所述的色谱条件：C18色谱柱 (50-150) X2. Imm, 3.0 ~5· Ομπι;流动相：乙腈：0· 1 %~1 % 甲酸水溶液 30:70 ~40:60， 等度洗脱，进样量：5~20 μ 1 ;柱温：35~45°C ;流速：0. 2~0. 3ml/min。
9. 如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤（4)中所述的质谱条件：辅 助气化电喷雾离子源ESI ;多反应离子监测MRM模式负离子检测，监测离子对分别为： m/z 883. 4 - 675. 2 朝藿定 A，m/z 853. 5 - 645. 3 朝藿定 B，m/z 867. 4 - 659. 4 朝 藿定C，m/z 721.3 -513. 2淫羊藿苷，m/z 579. 2 - 271. 1柚皮苷，辅助气化气流量： 7000~8000CC/min，雾化气流量：6~10L/min，气帘气流量：5~8L/min，离子源喷雾电 压：-3800~-4500V，离子源雾化温度：350-400°C。
10. 如权利要求1所述的检测方法，其特征在于包括如下步骤： 1) 对照品溶液的制备：朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷加甲醇溶解并稀释至 刻度，配制成4种lmg/ml对照品储备液。分别精密量取4种黄酮对照品储备液适量，置IOml 量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，摇匀，得混合对照品储备液； 2) 内标溶液的制备：取柚皮苷对照品，精密称定，置于量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻 度，配制成lmg/ml内标储备液。精密量取内标储备液适量，置于量瓶中，加入乙腈：0. 1%甲 酸水溶液35:65稀释至刻度，摇匀，得100 μ g/ml内标次级储备溶液。精密吸取内标次级储 备液置量瓶中，加乙腈：〇. 1%甲酸水溶液35:65稀释至刻度，摇匀，得到内标工作液2 μ g/ ml ； 3) 供试品溶液制备：用乙腈：0.1 %甲酸水溶液35:65稀释喘可治注射液2000倍，精密 量取1000 μ 1加内标工作液200 μ 1，涡旋40s，过0. 22 μ m滤膜，取续滤液，得供试品溶液； 4) 检测条件： 色谱条件 色谱柱(：18150\2.1111111，5.(^111、流动相乙腈：0.1%甲酸水溶液35 :65、等度洗脱 3. 5min、进样量 10 μ 1、柱温 40°C、流速 0· 22ml/min ; 质谱条件 辅助气化电喷雾离子源ESI ;多反应离子监测MRM模式负离子检测，监测离子对分别 为：m/z 883. 4 - 675. 2 朝藿定 A，m/z 853. 5 - 645. 3 朝藿定 B，m/z 867. 4 - 659. 4 朝藿 定(：，111/2 721.3 - 513.2淫羊藿苷，111/2 579.2 - 271.1柚皮苷，辅助气化气流量：7500〇：/ min，雾化气流量：8L/min，气帘气流量：6L/min，离子源喷雾电压：-4000V，离子源雾化温 度：350°C。
【专利摘要】本发明涉及一种喘可治注射液黄酮类有效成分检测方法，通过液相色谱质谱联用，能够同时分离并测定朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷四种有效成分，该方法稳定可靠并能够真实反映产品的质量，适合产业化的日常生产检验。
【IPC分类】G01N30-88, G01N30-06
【公开号】CN104634911
【申请号】CN201410778188
【发明人】杨柳, 朱雅玲, 许舜军, 余捷婧, 孙帅, 许艺镌, 许铮弟, 张和灿
【申请人】广州万正药业有限公司
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2014年12月15日