预测肾近曲小管细胞毒性的体外试验的制作方法
【专利说明】预测肾近曲小管细胞毒性的体外试验
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2012年7月20日提交的美国临时申请第61/674，024号的优先权和权益，其内容通过引用纳入本文。
技术领域
[0003]本发明涉及用于预测化合物对于肾近曲小管细胞的毒性(包括预测体内毒性)的体外试验方法。
【背景技术】
[0004]肾是药物诱导毒性的主要靶器官之一。肾毒性药物和化学品会诱导急性肾损伤(AKI)或慢性肾病，随后发展成晚期肾病(ESRD) (1-3)。AKI和ESRD患者具有上升患病率和死亡率，并且依赖于透析(1，4，5)。所有住院患者中有约5%而I⑶患者中有约20% -30%发展成AKI，并且这些病例中有约20%-25%归因于肾毒性药物(2-4)。当替代性药物和新药投入使用时，其肾毒性可能性通常被低估(6)，这再次导致临床并发症，如COX2抑制剂的情况(7)。
[0005]通常而言，仅在药物开发的晚期才检测肾毒性，并且导致临床前研宄期间药物缩减中的2%和3期中的19% (8) ο并且，由于于肾的大功能储备，肾毒性效应常常仅在监管方面批准之后变得明显。一个近期示例是替诺福韦，其损伤肾近曲小管(9，10)。并且，上述问题还与加入临床试验的患者和对象的风险升高，以及保健系统和制药业的基础成本相关联。一个主要问题是缺乏具有高度可预测性的临床前模型。动物模型的可预测性受种间差异性的影响，并且还存在其它问题，例如高成本和低通量。此外，欧盟(EU)的法制变化(REACH和化妆品指令的第七次修正)以及美国的新提案(ToxCast和Tox21)提高了对体外模型的兴趣。经监管批准或验证的预测人肾毒性的体外模型目前尚不可用。主要困难在于对合适细胞类型和终点的鉴定(11-13)。
[0006]在肾中，肾近曲小管(PT)细胞是药物诱导的毒性的主要目标，这归因于其在药物及有机化合物运输和肾小球过滤物浓缩中的作用(2，3)。PT源性的细胞系，例如人和猪细胞系ΗΚ-2(人肾-2)和LLC-PKl (Lewis肺癌-猪肾I)，已在体外肾毒理学中频繁应用。然而，永生细胞的敏感性低于人原生的肾近曲小管细胞(HPTC) (14)，并且对熟知的肾毒性物质不敏感(13)，这归因于与永生化相关联的功能变化和药物转运体表达变化(15-17)。此夕卜，与一般细胞毒性相关联的终点，例如细胞死亡、代谢活性或ATP损耗，均不能用于器官特异性毒性的研宄。检测用肝毒性、肾毒性和心脏毒性化合物处理肝脏、肾PT和心脏源性细胞系的ATP损耗的近期研宄发现，大多数化合物对所有三种细胞系具有相似作用(18)。
[0007]管控替代性方法的审核与批准的欧洲和美国监管机构(欧洲动物实验替代方法验证中心(ECVAM)和毒理学替代方法评估国家跨部门毒理学规划评价中心/替代方法验证跨部门协调委员会(NICEATM/ICCVAM))目前尚未对体外肾毒理学的验证方法采取任何措施。ECVAM已经对一项采用15种药物的验证前研宄给予了基金支持(19)。已采用有限数量的药物测试了在此后的过去10年间开发的用于体外肾毒理学的其它模型(20-24)，但这些模型的可预测性不明。近期开发的高通量线粒体肾毒性物质试验基于兔细胞(25)，其引发关于种间差异性的问题。在采用新鲜分离自鼠肾的PT的模型中也是同样情况(23，24)。这两种模型仍需使用动物。
【发明内容】
[0008]在一个方面，本发明提供用于筛选化合物的肾近曲小管毒性的体外方法。所述方法包括:使测试化合物和肾近曲小管细胞的测试群接触；和，检测一项或多项细胞的形貌特征(morphology features)，检测一项或多项细胞骨架特征(cytoskeleton features)，和/或测定测试群中肾近曲小管细胞的细胞数量；并且比较测试群和未接触测试化合物的对照群之间的细胞形貌、细胞骨架成分排列和/或细胞计数；其中一项或多项细胞形貌特征的变化、一项或多项细胞骨架特征的排列变化或测试群相对于对照群的细胞数量的减少指示该测试化合物对肾近曲小管细胞有毒性。
[0009]形貌特征的变化可包括近曲小管细胞的变圆程度增加、细胞面积减小和细胞核:全细胞比例升高中的一项或多项。细胞骨架排列特征的变化可包括F-肌动蛋白和微管蛋白之一或两者的排列变化。
[0010]所述方法还可包括，在检测和/或测定之前，用可检测的标记物标记测试群，和/或用可检测的标记物标记对照群。所述可检测的标记物可以是荧光标记物或有色标记物。所述可检测的标记物可以是核标记物、全细胞标记物、胞质标记物、细胞骨架蛋白标记物或细胞表面标记物。
[0011]在所述方法中，肾近曲小管细胞可源自体细胞或干细胞，包括例如原生细胞或来自稳定细胞系的细胞。例如，肾近曲小管细胞可源自体细胞，并且可以是人原生肾近曲小管细胞，HK-2细胞或LLC-PKl细胞。例如，肾近曲小管细胞可源自干细胞，并且可以从胚胎干细胞、间充质干细胞或诱导性多能干细胞分化而来。在一些实施方式中，肾近曲小管细胞是人肾近曲小管细胞。在一些实施方式中，肾近曲小管细胞是非人肾近曲小管细胞。
[0012]在该方法中，所述接触可进行一段时间，例如，约8小时或更长。所述接触可以是在约3?约14天的一段时间内重复一次或多次的接触。所述接触可包括向所述肾近曲小管细胞测试群添加浓度为约0.001?约1000 μ g/ml的测试化合物。
[0013]本领域技术人员根据本发明下面的【具体实施方式】的描述以及附图和表将会明白本发明的其它方面和特征。
【附图说明】
[0014]本申请的附图如下所述，这些附图仅通过示例方式说明本发明的实施方式。
[0015]图1.上图:市售HPTC(美国典型培养物保藏中心)；下图:分离自新鲜人肾样品的HPTC。细胞未处理(左图)或用0.2mg/ml的四环素(右上图)或庆大霉素(右下图)处理。用这些肾毒性物质处理导致形貌变化(绿色:F-肌动蛋白)以及由细胞核(蓝色)数量下降所示的细胞数量下降。这些变化均可通过HCS定量并且进行后续图像分析。
[0016]图2.将HPTC (ATCC)接种至多孔板，培养，然后不处理或用CdCl2 (10 μ g/ml)、马兜铃酸(100 μ g/ml)或顺铂(100 μ g/ml)处理。细胞采用相差显微镜成像。
[0017]图3 ?7.将 HPTC (ATCC)(图 3) ,LLC-PKl 细胞(图 4 和 6)以及 ΗΚ-2 细胞(图 5和7)接种进入多孔板，培养，然后不处理或用至多500 μ g/ml的CuCl2、CdCl2, K2Cr2O7或替诺福韦(图3?5)或庆大霉素、四环素、5-氟尿嘧啶或As2O3 (图6和7)处理。细胞核用DAPI染色，并且细胞通过高内涵筛选(HCS)法成像并计数。
[0018]图8.(表I)药物对细胞数量影响的比较。使HPTC (ATCC)、HK_2和LLC-PKl细胞接触浓度为I μ g/ml?1000 μ g/ml的41种测试化合物。基于HCS测定的细胞数量计算IC5tl值。若在化合物的最高浓度(100yg ml-1)时，细胞活力>50%，则赋予>1000 μ g ml_l的值。在一些情况中未测定到细胞数量(ND)。化合物I?22对人体具有肾毒性，并且直接损伤肾近曲小管。化合物23?33对人体具有肾毒性，但不直接损伤肾近曲小管。化合物34?41对人体无肾毒性。
[0019]图9.与载体对照(载体:水)、氧化铋(III)或10% DMS0(阳性对照)接触的HPTC的显微照片。
[0020]图10.未处理(阴性)对照，或接触浓度为1000 μ g/ml (上排)或500 μ g/ml (下排)重铬酸钾、氧化锗(IV)或乙酸铅的HPTC的显微照片。红色:F-肌动蛋白，蓝色:细胞核。
[0021]图11.未处理(阴性)对照，或接触浓度为1000 μ g/ml (上排)或500 μ g/ml (下排)百草枯、异环磷酰胺或嘌呤霉素(puryomycin)的HPTC的显微照片。红色:F-肌动蛋白，蓝色:细胞核。
[0022]图12.未处理(阴性)对照，或接触浓度为1000 μ g/ml (上排)或500 μ g/ml (下排)重铬酸钾、氧化锗(IV)或乙酸铅的HPTC的显微照片。绿色:α-微管蛋白，蓝色:细胞核。
[0023]图13.未处理(阴性)对照，或接触浓度为1000 μ g/ml (上排)或500 μ g/ml (下排)百草枯、异环磷酰胺或嘌呤霉素(puryomycin)的HPTC的显微照片。绿色:α -微管蛋白，蓝色:细胞核。
【具体实施方式】
[0024]提供一种预测化合物对肾近曲小管的体内毒性的体外试验，该试验采用培养的肾近曲小管细胞(PTC)，包括人原生肾近曲小管细胞(HPTC)或源自干细胞的PTC样细胞。所述试验基于在PTC或PTC样细胞中观察到的指示肾近曲小管(PT)毒性的不同形貌、细胞骨架和细胞数量的变化。
[0025]观察到当采用属于直接损伤PTC的肾毒性物质的化合物处理时，PTC趋于发生形貌变化，包括细胞变圆和细胞面积减小，还趋于发生细胞骨架成分(例如F-肌动蛋白或微管蛋白)的重排。细胞数量通常在响应PT损伤肾毒性化合物的细胞死亡后下降，其能通过用PT特异性肾毒性物质处理后对PTC的培养物中的细胞核数量计数来检测。
[0026]因此，提供一种筛选化合物PT特异性毒性的方法。简言之，所述方法包括使PTC的测试群与