一种改良的Grocott六胺银染色方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及昆虫病原真菌的染色方法，具体涉及一种改良的Grocott六胺银染色 方法，该方法特别适合在西花蓟马-白僵菌石蜡切片中应用。
【背景技术】
[0002] 西花蓟马Frankliniella occidentalis (Pergande)是一种世界性的农业害虫属 于缨翅目，蓟马科，花蓟马属。其寄主范围较广，目前已知的有60个科的500多种植物。2003 年西花蓟马首次在北京市发现，目前已成为我国露地和温室蔬菜生产的重要害虫。西花蓟 马对化学杀虫剂有较强的抗药性，所以对西花蓟马采取生物防治是非常必要的。尤其是白 僵菌经体壁感染昆虫，极其适合于锉吸式口器的西花蓟马的生物防治。因此探析白僵菌与 西花蓟马之间侵染过程和免疫反应，可为获得高杀虫活性的生物农药提供理论基础。
[0003] Gomori氏六胺银染色（GMS)原为1946年Gomori氏为显示糖原及粘液而设计的一 种组织染色。后经Grocott氏改良并推广应用到切片的真菌染色也得到较好的效果。其原 理为：真菌的细胞壁富含多糖，经过高碘酸的氧化后释放出醛基，直接将硝酸银还原成金属 银，从而使真菌染成棕黑色，有特异性强等特点。由于Grocott六胺银染色对温度有较高的 要求，且染色时间长等特点，因此在石蜡切片的应用过程中极易造成脱片现象。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术的缺陷，本发明的目的之一在于提供一种改良的Grocott六胺银染 色方法。
[0005] 本发明的另一目的在于提供一种上述改良的Grocott六胺银染色方法在石蜡切 片检测病原真菌侵染生物体方面的应用。
[0006] 本发明的染色方法通过对石蜡切片制作过程中的粘片、Grocott六胺银染色的染 色过程进行调整改变，从而克服石蜡切片的应用过程中极易造成脱片的缺陷。
[0007] 为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0008] 一种改良的Grocott六胺银染色方法，包括石蜡组织切片的制作步骤、染色步骤、 脱水透明步骤以及封片步骤，其中，
[0009] 在所述石蜡组织切片的制作步骤中，将切好的蜡片粘附于经APES处理的载玻片 上；
[0010] 所述染色步骤，依次包括如下子步骤：
[0011] 子步骤一，将脱赌水化后的切片置于0. 5-1 %高碘酸溶液中氧化30-40min后水 洗；
[0012] 子步骤二，将切片置于1 %亚硫酸钠溶液内Imin后流水冲洗，然后再采用蒸馏水 洗绦3次；
[0013] 子步骤三，将切片放入预先预热的乌洛托品银应用液中，在58°C条件下染色 90min，然后采用蒸馏水洗涤3-4次；
[0014] 子步骤四，用黄金氯水调色液调色3-5min，然后用蒸馏水洗涤5min ;
[0015] 子步骤五，用2%硫代硫酸钠溶液固定5min，然后水洗；
[0016] 子步骤六，核固红对比染色液染色8min，水洗5min ;
[0017] 所述溶液的百分比均为相应溶质质量与溶剂水的体积的百分比。
[0018] 在上述改良的Grocott六胺银染色方法中，作为一种优选实施方式，在所述石蜡 组织切片的制作步骤中，所述蜡片的厚度为8 μ m。
[0019] 在上述改良的Grocott六胺银染色方法中，作为一种优选实施方式，在所述石蜡 组织切片的制作步骤中，将粘附于载玻片上的蜡片置于温箱内烤片7天。更优选地，在所述 烤片结束后，先采用浓度梯度递减的酒精对切片进行脱蜡，然后用蒸馏水洗3min。
[0020] 在上述改良的Grocott六胺银染色方法中，作为一种优选实施方式，在所述子步 骤三中，所述预热是指在58°C恒温箱中预热15min。
[0021] 在上述改良的Grocott六胺银染色方法中，作为一种优选实施方式，在所述脱水 透明步骤中，采用浓度梯度递增的酒精脱水，采用二甲苯透明。
[0022] 在上述改良的Grocott六胺银染色方法中，作为一种优选实施方式，在所述封片 步骤中，采用中性树胶封片。
[0023] 在上述改良的Grocott六胺银染色方法中，作为一种优选实施方式，所述组织为 白僵菌侵染的西花蓟马的组织
[0024] 上述改良的Grocott六胺银染色方法在石蜡组织切片检测病原真菌侵染生物体 方面的应用。
[0025] 在上述应用中，所述病原真菌优选为白僵菌，所述生物体为西花蓟马。
[0026] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明的染色方法很好地解决了染 色过程容易脱片的缺陷，特别是对于体型较小的西花蓟马，在采用未改良Grocott六胺银 染色方法，染色过程极易脱片，而采用本发明的染色方法未脱片率达到70%以上。另外，本 发明染色方法得到的切片的虫体内部组织显红色，虫体内的芽生孢子呈现黑色，清晰可见， 染色效果极佳。本发明的方法可以用于其他昆虫病原真菌引起昆虫组织病理学变化的研 宄；用于医学病理切片；用于其他真菌的检测。
【附图说明】
[0027] 图1为经APES处理的玻片；
[0028] 图2为未经APES处理的玻片；
[0029] 图3为采用实施例1方法染色的西花蓟马及其体内侵染的白僵菌图片（尼康生物 显微镜，100);
[0030] 图4为采用实施例1方法染色的西花蓟马及其体内侵染的白僵菌的另一图片（尼 康生物显微镜，100);
[0031] 图5为采用对比例1-1方法染色的西花蓟马及其体内侵染的白僵菌的图片（尼康 生物显微镜，100);
[0032] 图6为采用对比例2-1方法染色的西花蓟马及其体内侵染的白僵菌的图片（尼康 生物显微镜，100);
[0033] 图7为采用对比例2-2方法染色的西花蓟马及其体内侵染的白僵菌的图片（尼康 生物显微镜，100)。
【具体实施方式】
[0034] 下面通过具体例对本发明进行详细说明，但本发明并不限于此。
[0035] 本发明中所述溶液的百分比均为溶质质量（g)与溶剂水的体积（mL)的百分比，比 如0. 5%高碘酸溶液即为0. 5g高碘酸溶于IOOmL水中得到的溶液。
[0036] 以下实施例和对比例中使用的各种化学试剂的配制方法及来源如下：
[0037] (1)六胺银染色液即乌洛托品银应用液的制备：乌洛托品银应用液依据乌洛托品 银原液配制而成。
[0038] 首先，配制乌洛托品银原液：
[0039] 取3%乌洛托品水溶液100mL、5%硝酸银水溶液5mL，将二者混合立即出现沉淀， 振荡沉淀溶解。4°C可保存数月。
[0040] 然后，配制乌洛托品银应用液：
[0041 ] 先将5 %硼酸水溶液4mL加入50mL蒸馏水内，然后再加入50mL上述乌洛托品银原 液，混匀。此乌洛托品银应用液应现配现用。
[0042] (2)核固红对比染色液的配制方法：
[0043] 先将5g硫酸铝溶解于IOOmL蒸馏水中以配制硫酸铝水溶液，然后再将0.1 g核固 红溶于上述硫酸铝水溶液中，经煮沸、冷却，过滤后室温保存得到的核固红对比染色液。
[0044] (3)黄金氯水调色液的配制：取1克氯化金（购自上海生工公司）溶于10克水中， 形成10%氯化金溶液；然后将10%氯化金溶液用水稀释100倍，得到1000 mLO. 1 %的黄金 氯水调色液。
[0045] (4)中性树胶：购自sigma。
[0046] (5) 10%中性甲醛固定液：购自上海远慕生物科技有限公司。
[0047] 本发明实施例和对比例中使用的白僵菌的获得方法：以自然感染白僵菌的草履 蚧僵虫体为原材料，按王俊平等（王俊平、郑长英，对蓟马类害虫高致病性球孢白僵菌的分 离、鉴定，茶叶科学，2011，31(4) :295~299)文献中记载的方法进行白僵菌的分离和培养。
[0048] 本发明实施例和对比例中使用的试验材料为接种上述白僵菌后72h的西花蓟马 成虫。采用喷雾法接种白僵菌，具体如下：将芸豆放入培养皿中，放入西花蓟马，将配好的白 僵菌IO 8CFUAiL孢悬液均匀喷到培养皿中，晾干，用保鲜膜覆盖，封口，72h后得到上述试验 材料。
[0049] 本发明实施例和对比例中所采用的染色器皿均经过洗净、烘干处理。
[0050] 实施例1
[0051] 染色方法具体为：
[0052] (1)石蜡组织切片的制作步骤，主要包括取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包 埋、切片与粘片、以及脱蜡和水化等工序，其中：
[0053] (a)取材的材料为接种白僵菌后72h的西花蓟马成虫；
[0054] (b)固定液采用10%中性甲醛固定液；
[0055] (c)切片采用莱卡切片机切片，切得的石蜡切片厚度为8 μπι ;
[0056] (d)粘片前载玻片用APES (3-氨丙基-3-甲氧基硅烷）处理，具体处理方法如下： 将载玻片用洗液（洗液的配制如下：将20g重铬酸钾溶于IIOmL蒸馏水中，然后逐滴加入浓 硫酸90mL，加入浓硫酸的速度以溶液不发热为度。）处理后，用100%酒精浸泡，再