一种多通道微流控-固相萃取-质谱联用装置及制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物化学领域，特别涉及一种多通道微流控-固相萃取-质谱联用装置及制备方法。
【背景技术】
[0002]近年来，微流控芯片技术在细胞研宄中不断获得新的应用和尝试。由于细胞内的生化反应通常为超微量和毫秒级，要求检测的高选择性、高灵敏度、快速响应和超小体积。在最初的微流控芯片-细胞研宄中，荧光和电化学检测常被用于已知或特定的一种或几种目标分子的检测，可以聚焦到几十微米直径的荧光激发光斑或微电化学电极能够很好地与芯片上的微检测区域耦合，实现高灵敏度检测。但是，细胞的化学成分复杂，一个生化反应通常伴随多种物质的转化和代谢。如何从复杂的干扰基质中快速地甄别出目标分子，检测方法除了高灵敏度外，还需要兼具高通量和高分辨的能力。质谱检测，依据质荷比的不同能一次性检测多种化合物，检测范围可涵盖大部分的生物小分子、多肽、蛋白质、酶和核酸等，已成为生物分析最重要的检测手段。近年来，快速发展的高分辨质谱技术具有fmol级的灵敏度和每秒数百张全谱扫描速度，能很好地监测细胞内瞬间的微量组分变化。同时，高分辨质谱的精确质量数测定可进行母离子和碎片离子的元素组成推测，通过中性丢失扫描进行多级碎片离子的原药物溯源，这是其他检测方法所无法比拟的。微流控芯片-质谱联用技术使细胞药物代谢研宄和细胞间信号传递的研宄深化到分子水平，虽然仅是初步研宄阶段，但其已显示出独特优势。微流控芯片-质谱联用系统进行活体细胞研宄时，最大限度地减少培养液中复杂成分和高浓度盐分对电离的影响，是准确获取细胞细微生化信息变化的关键。
[0003]在微流控芯片中细胞代谢物的检测已经开发出大量的新技术和新方法，针对不同的检测对象，需要采用不同的检测手段。较为直观的一类方法是荧光成像技术。微流控芯片大多是透明材料，将待测代谢物直接进行荧光标记后，使用荧光显微镜进行分析。广泛使用的蛋白质分析检测方法是免疫分析，利用免疫亲和原理从复杂基质中快速富集目标物质，利用芯片集成化的优势对细胞代谢物进行高通量的检测。然而这些方法在细胞研宄中检测灵敏度和精度都不高。质谱是目前用于分析有机物最为理想的检测器，灵敏度高，用于复杂体系中痕量物质的鉴定或结构测定，因此它也成为生命科学中进行分析研宄的重要手段之一。特别是对小分子和生物大分子的定性分析中，不仅能够提供分子结构的信息，而且在需要的时候还可以进行半定量的检测。因此微流控-质谱联用应用于细胞研宄已引起广泛关注。
[0004]目前，在低氧环境中研宄细胞行为的方法包括缺氧工作站及缺氧小室，但是这些方法不能形成氧气浓度梯度。为了满足该需要，各种微流体装置已经被开发用于严格控制氧含量。微流控技术为研宄低氧的微环境提供优秀平台。在微流控装置中，最直接最普遍的方法调控氧气浓度是通过扩散实现的，这种扩散是从流体源或控制通道使气体透过薄的透气性好的PDMS膜，从而制造在不同的低氧微环境中。流体源可以是液体也可以是气体。流体源是液体时，需要先平衡流体中的气体含量。先将流体进行氮吹，使流体中的氧气含量稳定，在连续通入芯片中，进而在芯片中得到理想的低氧环境。但是这种方法不能得到准确有效的数据，由于PDMS良好的气透性，通道中的流体会与芯片外空气中的气体重新达到一个平衡。气体流则不需要考虑这种再平衡的弊端。气体灌入的方便与简便是研宄人员希望可以完成更复杂的实验内容。但是气体控制需要复杂的芯片设计和精确的控制，需要外揭气瓶，操作繁琐。在细胞培养时，细胞在静态培养基中消耗的氧气足以产生低氧微环境，这种低氧为环境跟细胞的密度和代谢速度密不可分。然后细胞的生长状态并不是一致的，这导致芯片中的代谢速度不一样，再加上细胞的密度容易出现较大的误差，这种方法的重复性差。微流控装置中的氧气浓度可以通过芯片上发生的化学反应来调控，这主要是通过消耗少量的化学试剂产生或者消耗氧气从而实现芯片管道内的氧浓度梯度。这种方法不需要大型的高压气瓶、复杂的气体连接设备以及繁琐的流体控制系统，而直接利用除氧剂来在芯片内实现氧浓度梯度。
【发明内容】
[0005]本发明搭建了一种微流控-质谱联用装置，构建缺氧微环境模型。微流控芯片通过固相萃取分离芯片与质谱连接。固相萃取分离芯片可以对细胞代谢物进行除盐、分离、富集等操作。微流控芯片质谱联用不仅可以考察细胞的代谢行为，还可以对细胞代谢物进行半定量测定。首先，在微流控芯片上利用化学吸氧反应形成氧气浓度梯度。芯片设有八通道的阵列，构造的氧气浓度梯度范围广，可以同时观察细胞在不同氧气环境下的生理行为可以一次性实现对照实验、多浓度梯度平行刺激以及多区域检测。经固相萃取芯片分离富集，质谱实时检测，更直观更准确检测细胞代谢物，为研宄肿瘤细胞缺氧提供理论依据。
[0006]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
[0007]一种多通道微流控-固相萃取-质谱联用装置，所述联用装置包括微流控芯片和质谱仪；所述微流控芯片设置有上下两层通道，上层通道为细胞培养通道，上层通道两端分别设置有细胞培养通道的出入孔和下层化学吸氧通道的出入孔，下层通道为化学吸氧通道，所述化学吸氧通道内设置有化学吸氧剂，形成特定氧气浓度，上下两层通道通过一层透气膜相连。所述芯片通道导管与填充球型C18颗粒的固相萃取芯片入口相连，固相萃取芯片出口则通过石英毛细管与质谱仪相连。
[0008]优选的是，所述下层通道为八个通道的阵列
[0009]更优选的是，所述的八个通道内填充有不同浓度的邻苯三酚溶液。每个通道都与IM的氢氧化钠溶液混合，以形成不同氧浓度的微环境。
[0010]本发明还提供了一种多通道微流控-固相萃取-质谱联用装置的制造方法，包括如下步骤:
[0011](I)设计和绘制微通道图案，并打印到透明胶片上；
[0012](2)通过光刻刻蚀技术将上述图案转移到设定厚度的SU-8负光胶的硅基片模板上，并制得微流控芯片基材凸面；
[0013](3)将PDMS的A胶和B胶混合液浇筑于周围有围堰的微流控芯片基材凸面上，真空脱气、烘干、固化后，形成PDMS盖片；
[0014](4)将PDMS的A胶和B胶混合液倒在2寸硅片上，覆盖硅片面积的二分之一，硅片置于匀胶机上，设置匀胶机I速600转/秒，时间9s，II速1000转/秒，时间20s，烘干可得100微米厚的PDMS薄膜。
[0015](5)将上层PDMS盖片打孔后，与PDMS薄膜永久性键合，形成封闭微通道，之后再将氢氧化钠入口和邻苯三酚溶液的入口及出口打孔，再与下层芯片键合即可得到微流控芯片;
[0016](6)将C18悬浮液注入固相萃取芯片中，利用芯片出口的楔形结构拦截C18球形颗粒并使其在通道中聚集，形成填充柱，
[0017](7)芯片出口通过石英毛细管导入质谱，即得。
[0018]优选的是，步骤(3)中，所述PDMS的A胶和B胶混合液中，A胶和B胶的质量比为
10:1ο
[0019]优选的是，步骤(6)中，所述C18悬浮液中C18球形颗粒与甲醇的质量比为1:200。
[0020]本发明的有益效果:
[0021]本发明搭建了一种微流控-质谱联用装置，构建缺氧微环境模型。微流控芯片通过固相萃取分离芯片与质谱连接。固相萃取分离芯片可以对细胞代谢物进行除盐、分离、富集等操作。微流控芯片质谱联用不仅可以考察细胞的代谢行为，还可以对细胞代谢物进行半定量测定。首先，在微流控芯片上利用化学吸氧反应形成氧气浓度梯度。芯片设有八通道的阵列，构造的氧气浓度梯度范围广，可以同时观察细胞在不同氧气环境下的生理行为可以一次性实现对照实验、多浓度梯度平行刺激以及多区域检测。经固相萃取芯片分离富集，质谱实时检测，更直观更准确检测细胞代谢物，为研宄肿瘤细胞缺氧提供理论依据。
【附图说明】
[0022]图1芯片设计图，其中，a上层芯片结构，b为下层芯片。其中I位氢氧化钠入口，2为8个邻苯三酚入口，3为8个细胞培养通道，4为氢氧化钠和邻苯三酚混合液出口，5为氢氧化钠与不同浓度的邻苯三酚溶液混合后形成不同氧气浓度的区域。
[0023]图2固相萃取柱设计图。
[0024]图3氧气浓度Cq2与荧光强度I的关系。
[0025]图4氧气浓度与邻苯三酚浓度的关系。
[0026]图5微流控芯片-质谱联用装置的一个操作单元示意图。
[0027]图6微流控芯片-质谱联用装置实物图。
【具体实施方式】
[0028]以下通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规的方法和条件进行选择。
[0029]实施例:
[0030]1、仪器和试剂
[0031]Sylard 184聚二甲基硅氧烷(PDMS，包括A胶PDMS预聚物和B胶固化剂，道康宁公司，美国)，邻苯三酚(国药集团化学试剂有限公司)，NaOH(北京化工厂)，甲醇(北京化工厂)，无水乙醇(北京化工厂)，三(4，7-联苯-1，10菲咯啉)二氯化钌(II)复合物(sigm