一种液相色谱-质谱联用分析长链多不饱和脂肪酸甘油三酯的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种液相色谱一质谱联用技术分析长链多不饱和脂肪酸甘油三酯的方法及其在富含长链多不饱和脂肪酸甘油三酯的油脂样品分析中的应用。
技术背景
[0002]长链多不饱和脂肪酸(Long-chainpolyunsaturated fatty acids，LC-PUFAs)是指含有两个或两个以上双键且碳链长度为18-22个碳原子的直链脂肪酸，根据第一个不饱和键位置不同，PUFAs可分为ω-3、ω-6、ω-7、ω-9等系列。ω-3系多不饱和脂肪酸主要包括 α -亚麻酸(a -Linolenic acid，a -Ln)、二十碳五稀酸(Eicosapentaenoic acid,EPA)和二十二碳六稀酸(Docosahexaenoic acid，DHA) ; ω-6系多不饱和脂肪酸主要有亚油酸(Leinoleic acid，L)、γ -亚麻酸(Linolenic acid，γ -Ln)和花生四稀酸(ARA)。多不饱和脂肪酸与人体健康息息相关，尤其是DHA，EPA, AM等长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFAs)，在维护细胞膜的结构和功能，预防和治疗心血管疾病，动脉硬化，癌症，肥胖等疾病方面具有明显效果。而甘油三醋(Triacylglycerols，TAGs)作为脂肪酸最主要的存在形式，由I个甘油分子和3个脂肪酸分子脱水缩合而成。脂肪酸在甘油三酯中甘油骨架上的分布位置有两类:sn-l，3(α )和sn_2 ( β )。长链多不饱和脂肪酸在TAGs中的分布位置决定着油脂的吸收代谢情况。例如，二十二碳五烯酸(EPA)及二十二碳六烯酸(DHA)处于sn-2位比处于sn-1，3位的吸收利用要有效得多。因此，对LC-PUFAs TAGs中脂肪酸酰基位置进行剖析对于揭示LC-PUFAs的营养学特性有着重要的意义。
[0003]HPLC法不受热稳定性和挥发性的限制，已广泛用于油脂分析中。迄今为止，非水反相液相色谱和正相银离子液相色谱是分离油脂中甘油三酯组成的两种主要方法。甘油三酯在非水反相液相色谱(商品化的C18柱)中的保留取决于当量碳数(equivalent carbonnumber，ECN)，即甘油三酯中酰基链总碳数(CNs)减去两倍的双键数(DBs)。但非水反相液相色谱很难分离具有相同ECN值的甘油三酯；对甘油三酯位置异构体的分离选择性也较差。银离子正相液相色谱利用银离子(Ag+)与甘油三酯分子中不饱和脂肪酸双键的络合吸附作用来提高对甘油三酯化合物的分离选择性。甘油三酯在银离子色谱中的保留取决于甘油三酯的双键数目、双键位置等因素。但双键数越多，TAG在银离子色谱柱上的保留时间越长甚至根本不能被洗脱；且即使将多根银离子色谱柱串联使用，仍无法实现双键数大于7的LC-PUFA TAG位置异构体的分离。
[0004]LC-PUFAs TAGs碳链长，双键数目多，结构复杂，同时存在大量的同分异构体和位置异构体，其在色谱柱上的保留行为与低碳链数、低饱和度的甘油三酯有所不同，传统的分析低碳链数、低饱和度的甘油三酯的液相色谱方法并不适合用于LC-PUFAs TAGs的分析。因此建立一种液相色谱一质谱联用技术分析长链多不饱和脂肪酸甘油三酯的方法显得尤为重要。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种液相色谱一质谱联用分析长链多不饱和脂肪酸甘油三酯的方法，该方法操作简单，能够实现长链多不饱和脂肪酸甘油三酯的高效、高通量的检测。
[0006]为实现上述目的，本发明的技术方案是:
[0007]一种液相色谱一质谱联用分析长链多不饱和脂肪酸甘油三酯的方法，使用的色谱柱为安捷伦Zorbax Eclipse Plus PAH色谱柱，该色谱柱具有“槽式结构”和疏水相互作用，可以实现单柱液相色谱分离长链多不饱和脂肪酸甘油三酯及其酰基位置异构体，其特征在于:它包括如下步骤:
[0008]I)长链多不饱和脂肪酸甘油三酯的液相色谱-质谱分离:
[0009]长链多不饱和脂肪酸甘油三酯标准品用异丙醇溶解，配成lmg/mL的溶液，进样前用相应的流动相稀释成0.01mg/mL，此处流动相为:90% (v/v)乙腈，10%异丙醇(v/v)；液相色谱柱为安捷伦Zorbax Eclipse Plus PAH(4.6mmX 150mm 1.d.)色谱柱，进样体积为10 μ L ;采用梯度洗脱，流动相为A:乙腈、B:异丙醇；梯度洗脱:0-30min (不含Omin)，90%-30% (v/v) A (10%-70% B，v/v)，保持 Imin ;31_31.Imin (不含 31min)，30-90% (v/v)A(70-10% B, v/v) ;31.1- 35min (不含 31.lmin)，90% (v/v) A(30% B, v/v);流速 lmL/min;在该条件下同时实现8种双键数不同、当量碳数相同和不同的甘油三酯标准品的分离；
[0010]2)长链多不饱和脂肪酸甘油三酯酰基位置异构体的液相色谱-质谱分离:
[0011]长链多不饱和脂肪酸甘油三酯酰基位置异构体标准品用异丙醇溶解，配成lmg/mL的溶液，进样前用流动相稀释成0.01mg/mL，此处流动相为:90% (v/v)乙腈，10% (v/v)异丙醇；进样体积为10 μ L，液相色谱柱为安捷伦Zorbax Eclipse Plus PAH(4.6mmX 250mm1.d.)色谱柱；采用梯度洗脱，流动相为A:乙腈、B:异丙醇；梯度洗脱:0-60min，90% -30%(v/v) A (10% -70% B，v/v);保持 lmin，61.0-61.lmin, 30-90% (v/v) A (70-10 % B，v/v)；
61.1 - 65min,90% (v/v) A (10% B, v/v);流速lmL/min ;在该条件下实现长链多不饱和脂肪酸甘油三酯酰基位置异构体EpEpP/EpPEp标准品的分离；
[0012]3)在分析油脂样品(富含长链多不饱和脂肪酸甘油三酯的油脂样品)时，包括如下步骤:
[0013](I)富含长链多不饱和脂肪酸甘油三酯的油脂样品用丙酮溶解，配成lmg/mL的溶液，进样前用流动相稀释成0.05mg/mL，此处流动相为:90%乙腈，10%异丙醇(v/v);进样体积为10uL，采用步骤2)的方法，测试富含长链多不饱和脂肪酸甘油三酯的油脂样品，得到富含长链多不饱和脂肪酸甘油三酯的液相色谱-质谱数据；
[0014](2)根据液相色谱一质谱数据对富含长链多不饱和脂肪酸甘油三酯的油脂样品中的长链多不饱和脂肪酸甘油三酯及其酰基位置异构体进行鉴定和定性分析；
[0015]其中:
[0016]a)所得的数据为富含长链多不饱和脂肪酸甘油三酯的油脂样品中甘油三酯的谱图和谱峰数据；
[0017]b)所述的富含长链多不饱和脂肪酸甘油三酯的油脂样品包括海豹油、鱼油或微生物油等。
[0018]所述步骤3)包括如下具体步骤:富含长链多不饱和脂肪酸甘油三酯的油脂样品中长链多不饱和脂肪酸甘油三酯的分离检测:油脂样品用丙酮溶解，配成lmg/mL的溶液，进样前用流动相稀释成0.05mg/mL，此处流动相为:90%乙腈，10%异丙醇(v/v);进样体积为 10 μ L，液相色谱柱为安捷伦 Zorbax Eclipse Plus PAH(4.6mmX 250mm 1.d.)色谱柱；采用梯度洗脱，流动相为A:乙腈、B:异丙醇；梯度洗脱:0-60min,90% -30% (v/v)A(10% -70% B, v/v);保持 lmin，61.0-61.lmin，30-90% (v/v) A(70-10% B, v/v) ；61.1 -65min,90% (v/v) A(10% B，v/v);流速lmL/min ;柱温35°C ;在该条件下实现富含长链多不饱和脂肪酸甘油三酯的油脂样品中长链多不饱和脂肪酸甘油三酯的分离，得到富含长链多不饱和脂肪酸甘油三酯的液相色谱-质谱数据；进一步根据液相色谱一质谱数据对富含长链多不饱和脂肪酸甘油三酯的油脂样品中的长链多不饱和脂肪酸甘油三酯及其酰基位置异构体进行鉴定和定性分析。
[0019]对富含长链多不饱和脂肪酸甘油三酯的油脂样本进行液相色谱-质谱数据采集，液相色谱-质谱分析得到油脂样品中甘油三酯的定性数据。其中，液相色谱分析条件为美国 Agilent 公司 Agilentl200 液相色谱仪，配有美国 Applied B1systems 公司 4000Q_Trap质谱检测器。质谱 APCI (atmospheric pressure chemical 1nizat1n)模式:正离子；温度(Temperature, TEM):450°C ;扫描模式:EMS_EPI ;扫描速度:1000u/s ;离子源气体 I (1nSource Gasl, GSl):344.75k