保护异硫氰酸荧光素与抗原抗体偶联物的稳定剂及其制备方法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫分析测定用试剂技术领域，尤其涉及保护异硫氰酸荧光素与抗原 抗体偶联物的稳定剂及其制备方法和用途。
【背景技术】
[0002] 在免疫分析测定中，采用异硫氰酸荧光素（FITC)抗体偶联固相载体，FITC偶联特 异性抗体或抗原的级联放大技术能够大大提高分析试剂的灵敏度和线性范围，并且可以实 现固相载体通用化，便于生产、降低成本。但FITC与抗原或抗体的偶联物稀释为浓度较低 的工作液后稳定性大幅降低，容易水解失活，若受到光照则更会加速其失活。为防止FITC 与抗原或抗体的偶联物活性降低，影响分析测定准确度，现有技术中，一般使用含有动物血 清、牛血清白蛋白、酪蛋白等成分的稀释液保护FITC与抗原或抗体的偶联物的稳定性，虽 然起到一定的稳定作用，但作用有限，通常保存一年（保存温度2~8°C )后活性剩余60~ 80 %，不能很好的满足免疫分析测定应用。
[0003] 因此，亟需开发一种稳定剂，有效保护异硫氰酸荧光素与抗原或抗体偶联物的稳 定性，避免由于其稳定性不好导致试剂盒的有效期过短、空白限等性能参数逐渐下降，从而 满足免疫分析测定的要求，保障分析测定的效果。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是，针对现有技术存在的问题，提供保护异硫氰酸荧光素与抗原抗 体偶联物的稳定剂及其制备方法和用途，有效保护异硫氰酸荧光素与抗原抗体偶联物的稳 定性，从而为相关分析测试提供保障。
[0005] 本发明解决问题的技术方案是：保护异硫氰酸荧光素与抗原抗体偶联物的稳定 剂，所述稳定剂的原料组分包括三羟甲基氨基甲烷（Tris)、0 _乳球蛋白、N，N二甲基二吖 啶硝酸盐、鱼皮凝胶、多聚赖氨酸和水。
[0006] 在本发明保护异硫氰酸荧光素与抗原抗体偶联物的稳定剂中，优选地，每1L所述 稳定剂中含有的原料组分如下：三轻甲基氨基甲烧〇. Olmol、|3 -乳球蛋白lg~5g、N，N二 甲基二吖啶硝酸盐lmg~3mg、鱼皮凝胶lg~3g、多聚赖氨酸0. lg~lg、余量为水。
[0007] 在本发明保护异硫氰酸荧光素与抗原抗体偶联物的稳定剂中，优选地，所述稳定 剂的pH为7~9。
[0008] 在本发明保护异硫氰酸荧光素与抗原抗体偶联物的稳定剂中，优选地，所述稳定 剂的pH为8。
[0009] 上述保护异硫氰酸荧光素与抗原抗体偶联物的稳定剂的制备方法，将上述保护异 硫氰酸荧光素与抗原抗体偶联物的稳定剂的各原料三羟甲基氨基甲烷、乳球蛋白、N， N二甲基二吖啶硝酸盐、鱼皮凝胶和多聚赖氨酸在水中充分搅拌至完全溶解并混合均匀，即 得到保护异硫氰酸荧光素与抗原抗体偶联物的稳定剂。
[0010] 优选地，在室温下，将所述稳定剂的各原料即三羟甲基氨基甲烷、乳球蛋白、N， N二甲基二吖啶硝酸盐、鱼皮凝胶和多聚赖氨酸在水中充分搅拌至完全溶解并混合均匀后， 用4mol/L盐酸调pH至7~9,制备完成后置于2~8°C下保存。
[0011] 本发明还提供了上述保护异硫氰酸荧光素与抗原抗体偶联物的稳定剂的用途，将 其用于免疫分析测定；优选地，在免疫分析测定中，将异硫氰酸荧光素与抗原抗体偶联物用 所述保护异硫氰酸荧光素与抗原抗体偶联物的稳定剂稀释。
[0012] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明能够有效的保护FITC与抗原抗体 偶联物的稳定性，能够使FITC与抗原抗体偶联物工作液保存一年（2~8°C)后活性剩余达 到95%以上，相较于现有常规用试剂，使FITC与抗原抗体偶联物的稳定性得到大幅提高， 显著延长了相关试剂盒的有效期，并使得试剂盒能够长期保持良好的性能参数；且制备方 法简单，经济成本低，适于在相关免疫分析测定领域推广应用。
【附图说明】
[0013] 图1为现有技术试剂1'号4°C保存6天的空白限评价中A、B点连点拟合曲线及 其对应的一次方程；
[0014] 图2为现有技术试剂1'号37°C保存6天的空白限评价中A、B点连点拟合曲线及 其对应的一次方程；
[0015] 图3为由实施例1所得稳定剂稀释制备的试剂1号4°C保存6天的空白限评价中 A、B点连点拟合曲线及其对应的一次方程；
[0016] 图4为由实施例1所得稳定剂稀释制备的试剂1号37°C保存6天的空白限评价中 A、B点连点拟合曲线及其对应的一次方程；
[0017] 图5为由实施例2所得稳定剂稀释制备的试剂1号4°C保存6天的空白限评价中 A、B点连点拟合曲线及其对应的一次方程；
[0018] 图6为由实施例2所得稳定剂稀释制备的试剂1号37°C保存6天的空白限评价中 A、B点连点拟合曲线及其对应的一次方程；
[0019] 图7为由实施例3所得稳定剂稀释制备的试剂1号4°C保存6天的空白限评价中 A、B点连点拟合曲线及其对应的一次方程；
[0020] 图8为由实施例3所得稳定剂稀释制备的试剂1号37°C保存6天的空白限评价中 A、B点连点拟合曲线及其对应的一次方程。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并 不限于此。
[0022] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用百分数如无 特殊说明均指质量百分含量。
[0023] 下述实施例中所用的材料、试剂等，除特别说明外，均可从商业途径得到。
[0024] 实施例1
[0025] 本发明的一种保护异硫氰酸荧光素与抗原抗体偶联物的稳定剂，将原料三羟甲基 氨基甲烷、0 -乳球蛋白、N，N二甲基二吖啶硝酸盐、鱼皮凝胶和多聚赖氨酸在水中充分搅 拌至完全溶解并混合均匀制得，每1L所得稳定剂中含有的原料组分如下：三羟甲基氨基甲 烷0.0 lmol、0 -乳球蛋白lg、N，N二甲基二吖啶硝酸盐lmg、鱼皮凝胶lg、多聚赖氨酸0. lg、 余量为水。
[0026] 在上述实施例中，为增强对异硫氰酸荧光素与抗原抗体偶联物的保护效果，优选 地，在室温下，将所述稳定剂的各原料即三羟甲基氨基甲烷、乳球蛋白、N，N二甲基二吖 啶硝酸盐、鱼皮凝胶和多聚赖氨酸在水中充分搅拌至完全溶解并混合均匀后，用4mol/L盐 酸调pH至7~9,较佳地，调pH至8,制备完成后置于2~8°C下保存。
[0027] 实施例2
[0028] 本发明的一种保护异硫氰酸荧光素与抗原抗体偶联物的稳定剂基本制备方法同 实施例1，其中，每1L所得稳定剂中含有的原料组分如下：三羟甲基氨基甲烷O.Olmol、 0-乳球蛋白3g、N，N二甲基二吖啶硝酸盐3mg、鱼皮凝胶3g、多聚赖氨酸0. 55g、余量为水。
[0029] 实施例3
[0030] 本发明的一种保护异硫氰酸荧光素与抗原抗体偶联物的稳定剂基本制备方法同 实施例1，其中，每1L所得稳定剂中含有的原料组分如下：三羟甲基氨基甲烷O.Olmol、 0- 乳球蛋白5g、N，N二甲基二吖啶硝酸盐5mg、鱼皮凝胶5g、多聚赖氨酸lg、余量为水。
[0031] 对上述实施例所制得的保护异硫氰酸荧光素与抗原抗体偶联物的稳定剂分别进 行应用测试，以前列腺特异性抗原磁微粒化学发光免疫分析试剂（PSA试剂）为例，测定 试剂1号的37°C的加速稳定性，试剂1号中的FITC与PSA抗体偶联物分别用上述实施例 1- 3制得的稳定剂配制成工作液。具体地，所述的PSA试剂包括：含有FITC偶联PSA抗体 的溶液，简称试剂1号；偶联有FITC抗体的磁微粒的悬浮液，简称磁分离试剂；碱性磷酸酶 (ALP)标记的PSA抗体的溶液，简称试剂2号。所述PSA试剂制备方法如下：
[0032] 1、试剂1号的制备
[0033] (1)制备用材料与仪器：以Tris缓冲液保存的PSA抗体，纯度超过99%，浓度为 5mg/mL ;异硫氰酸荧光素（FITC)，碳酸氢钠等试剂应达到化学纯；G-25凝胶纯化柱采购自 GE公司；
[0034] (2)制备步骤：
[0035] ①用0? 2m〇L/L pH为9. 0的碳酸盐缓冲液配制0? 5mg/mL的FITC溶液；
[0036] ②按照PSA抗体与FITC分子比为1:10的比例在抗体溶液中加入步骤①所配制的 FITC溶液，混合均匀后，室温下静置反应12h小时，得到PSA抗体-FITC偶联物；
[0037] ③将步骤②的反应液通过G-25凝胶柱进行分离，去除未反应的FITC，得到含有 PSA抗体-FITC偶联物（即FITC标记的PSA抗体）的溶液；
[0038] ④用上述实施例1或实施例2或实施例3中所得的稳定剂将步骤③所得含有PSA 抗体-FITC偶联物的溶液稀释为工作液，即制得试剂1号。
[0039] 2、试剂2号的制备
[0040] (1)材料与仪器：以Tris缓冲液保存的PSA单克隆抗体，纯度超过98%，浓度为 4mg/mL，下称PSA抗体溶液；以磷酸缓冲液保存的碱性磷酸酶（ALP溶液），ALP纯度为99% 以上，ALP比活性为1200U/mg，ALP溶液浓度为17. 5mg/mL ;5mg/mL SMCC(4-(N-马来酰亚 胺基甲基）环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯）溶液、10mg/mL 2-IT(2-亚氨基硫烷盐酸盐） 溶液，其中，SMCC溶液采用固体粉末状交联剂SMCC用DMF (二甲基甲酰胺）溶解配制而成， 2-IT溶液采用固体粉末状2-IT用DMF(二甲基甲酰胺）溶解配制而成，所用SMCC、2-IT均 购自Sigma公司；Tris等化学试剂应达到化学纯；G-25凝胶纯化柱、AKTA-PURE蛋白纯化仪 和Supperdex200凝胶纯化柱均为GE公司产品；
[0041] (2)制备步骤：
[0042] ①取