一种磷脂的电致化学发光检测方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属生物技术领域，具体涉及一种磷脂的电致化学发光检测方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 磷脂为两性分子，两端分别为含氮或磷的基团、疏水长烃链，在细胞信号和细胞凋 亡中起到重要作用。根据不同碱基及脂肪酸的数量，磷脂可以分为卵磷脂（PC)、磷脂酰丝 氨酸（PS)、溶血磷脂酰胆碱（LPC)，其骨架由甘油组成。磷脂可以进行水解、羟基化、乙酰基 化、磺化、活化等反应。
[0003] 磷脂的代谢与甲基化循环相关，在生物体内磷脂可经各种磷脂酶水解为脂肪酸、 磷酸、甘油和各种氨基醇。甘油可转变为磷酸二羟丙酮从而参与糖的代谢，磷酸，人们体内 物质各种代谢不可缺少的物质，氨基醇可以参加体内磷脂再合成，胆碱还可以通过转甲基 作用转变为其他组份。对于磷脂的合成，通过乙醇胺或胆碱与ATP作用生成磷酸乙醇胺或 磷酸胆碱，再与CTP作用转变为胞二磷乙醇胺或胞二磷胆碱，接下来再与已经生成的甘油 二酯合成相应的磷脂。
[0004] 对于磷脂的分析，传统的分析方法检测方法有很多，如分光光度法测定磷元素，这 是基于含钼试剂和磷脂进行显色反应产生蓝色产物；色谱技术如薄层色谱法、高效液相色 谱法及气相色谱法也可用于磷脂的检测，与显色法对比，色谱法干扰少，方便快捷，可以将 混合磷脂中各个组份分别分离出来并定量，同时可测磷脂在储存过程中是否发生水解和氧 化；现在高效液相色谱法和质谱法联用是检测磷脂最常用的方法，Lewen Jia等（Jia L， Wang C, Kong H,et al. Plasma phospholipid metabolic profiling and biomarkers of mouse IgA nephropathy [J].Metabolomics，2006, 2 (2) :95-104)用质谱串联液相色谱四 级杆复合线性离子阱，采用二醇色谱柱，通过调节流动相组成，实现了血浆中磷脂的快速分 离，赵素敏等（赵素敏，郑虹，路鑫等，基于液相色谱与质谱联用的代谢组学及磷脂轮廓分 析在糖代谢异常研宄中的应用）利用高效液相与质谱联用分析到糖尿病血浆中代谢组学 及磷脂轮廓原始谱图，根据模型及相关数据的分析筛选出差异性代谢物。尽管上面研宄磷 脂的方法已经很多了，但这些技术都无法应用于检测单细胞中的磷脂。鉴于细胞的个体差 异性，能够检测出单个细胞表面的磷脂分子含量，对于很多脂类疾病的研宄具有重大意 义。
【发明内容】
[0005] 发明目的：为解决现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种磷脂的电致化学 发光检测方法，该方法可用于测定细胞表面磷脂，同时还可以测定单个细胞表面磷脂，检测 灵敏度高、专一性好。
[0006] 技术方案：为实现上述技术方案，本发明提出一种磷脂的电致化学发光检测方法， 其特征在于，包括如下步骤：
[0007] (1)将待检测磷脂浸泡在低离子强度溶液中使磷脂活化，然后将活化后的磷脂用 磷酸缓冲液冲洗并浸泡待用；
[0008] (2)将经步骤⑴处理后的待检测磷脂浸入含有鲁米诺或L012的磷酸缓冲液中， 以ITO为工作电极，Ag/AgCl、Pt分别为参比电极和对电极，利用电致化学发光法检测发光 强度1〇,然后向其中加入磷脂酶D和胆碱氧化酶的混合溶液，反应1~2min以后，再次检测 发光强度I 1，计算加入磷脂酶D和胆碱氧化酶的混合溶液前后发光强度的变化Ι/Ιρ
[0009] 其中，步骤（1)中，所述的低离子强度溶液为包含0. 5mM磷酸缓冲液（PBS，pH 7. 4) 和3IOmM蔗糖的低离子强度溶液。
[0010] 步骤⑵中，鲁米诺或L012的浓度为180~200 μ M ;磷脂酶D的浓度为8~IOU/ ml;胆碱氧化酶的浓度为1~5U/ml，优选地，磷脂酶D和胆碱氧化酶的体积比为3 : 7。
[0011] 具体地，所述的电致化学发光法的检测过程为：在ITO表面黏上一个O型圈，向O 型圈内加入待检的磷脂和鲁米诺的磷酸缓冲液，在ITO上加扫描速度为1V/S，-1.0 V~1.0 V 的电压，光电倍增管电压为500V，记录背景发光强度Itl;待基线平稳后，暂停，从上端静态注 射入口向0型圈内再加入磷脂酶D和胆碱氧化酶的混合溶液，等待反应1~2min后继续记 录发光强度I 1，计算加入磷脂酶D和胆碱氧化酶的混合溶液前后发光强度的变化L/%。
[0012] 本发明进一步提供了一种细胞磷脂的电致化学发光检测方法，其特征在于，包括 如下步骤：
[0013] (1)将待检测细胞浸泡在低离子强度溶液中使细胞表面磷脂活化，然后将活化后 的细胞用磷酸缓冲液冲洗并浸泡待用；
[0014] (2)将经步骤⑴处理后的待检测细胞浸入含有鲁米诺或L012的磷酸缓冲液中， 以ITO为工作电极，Ag/AgCl、Pt分别为参比电极和对电极，利用电致化学发光法检测发光 强度1〇,然后向其中加入磷脂酶D和胆碱氧化酶的混合溶液，反应1~2min以后，利用电致 化学发光法检测发光强度^计算加入磷脂酶D和胆碱氧化酶的混合溶液前后发光强度的 变化W
[0015] 优选地，步骤⑴中，所述的低离子强度溶液为包含0. 5mM磷酸缓冲液（PBS，pH 7. 4)和310mM蔗糖的低离子强度溶液。
[0016] 步骤⑵中，鲁米诺或L012的浓度为180~200 μ M ;磷脂酶D的浓度为8~IOU/ ml;胆碱氧化酶的浓度为1~5U/ml，优选地，磷脂酶D和胆碱氧化酶的体积比为3 : 7。
[0017] 其中，所述的电致化学发光法定的检测过程为：在ITO表面黏上一个0型圈，向0 型圈内加入待检的细胞和鲁米诺的磷酸缓冲液，在ITO上加扫描速度为1V/S，-1.0 V~1.0 V 的电压，光电倍增管电压为500V，记录背景发光强度Itl;待基线平稳后，暂停，从上端静态注 射入口向0型圈内再加入磷脂酶D和胆碱氧化酶的混合溶液，等待反应1~2min后继续记 录发光强度I 1，计算加入磷脂酶D和胆碱氧化酶的混合溶液前后发光强度的变化L/%。
[0018] 本发明进一步提出了上述检测方法在检测单细胞表面磷脂上的应用，其特征在 于，包括如下步骤：
[0019] (1)将待检测细胞浸泡在低离子强度溶液中使细胞表面磷脂活化，然后将活化后 的细胞用磷酸缓冲液冲洗并浸泡待用；
[0020] (2)利用微加工技术，在ITO形成30 μ m的单洞，将步骤（1)处理后的单个细胞引 入到单洞中，加入鲁米诺或L012的磷酸缓冲液