一种中药中赭曲霉毒素a的净化新方法及检测技术的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种中药中赭曲霉毒素 A的净化新方法，特别是涉及适体亲和柱 (AAC)的制备，AAC净化超高效液相荧光检测及液质联用检测中药中赭曲霉毒素 A，其属于 真菌毒素检测领域。
【背景技术】
[0002] 赭曲霉毒素 A(ochratoxinA，0ΤΑ)是异香豆素联结L-苯丙氨酸的衍生物，由曲霉 菌属和青霉菌属等产毒菌株产生的二级代谢产物，具有很强的肝肾毒性、神经毒性及免疫 毒性等，故1993年国际癌症组织IARC已将其定义为2B类致癌物。OTA在全球污染范围较 广，其广泛存在于各类食品及农作物中，且污染水平较高。近年来，一些诸如甘草、生姜、姜 黄等中草药及其制品也被发现污染0ΤΑ，且污染状况不容小觑。但由于中药材种类繁多、基 质复杂、加工和储藏尚存在不当之处加之OTA痕量（ppb)、pH敏感性等特点，实际检测困难 重重。故目前除了欧盟（EU)对甘草和芳香植物做了相关的OTA限量规定外，其他国家尚 处于摸索阶段，特别是我国相关组织对中药材OTA的限量还是空白。因而寻找一种简单、 快速、准确、经济、特异性的前处理方法，消除中药基质干扰，对于研究中药中OTA的污染状 况，制定中药中OTA的限量标准具有重要意义。
[0003] 适体（aptamer)是通过指数富集配基系统进化技术（SELEX)体外筛选得到的一类 与目标分子高特异性结合的寡聚核苷酸片段。作为靶物质识别元件，与抗体相比aptamer 具有多重优势，如其合成往往可通过体外化学合成，而抗体则需在一定的生理条件下，故 aptamer受环境的影响较小，易于修饰，且制备更为经济，此外aptamer对结构类似物的识 别能力更强，可达到nM级别，而抗体往往存在交叉反应。因此其作为一个优于抗体的新型 识别配基，已在食品快速检验、环境检测、临床诊断和治疗以及毒理研究等领域展示了良好 的应用前景。
【发明内容】
[0004] 本发明旨在提供一种制备方法简单、偶联速度快、偶联效率高、净化效果好可有 效排除中药基质的干扰的AAC的制备方法，其优点在于以适体为特异性配基，NHS活化的 sepharose4FF为载体，将这两者的优势联合起来，起到高效偶联，快速净化的目的，操作简 单，价格低廉，能够应用于不同中药部位，消除不同中药成分的干扰，具有广阔的开发前景。
[0005] 技术解决方案
[0006] 本发明采用的技术方案是：优选、合成和末端修饰OTA适体序列，再在一定条件下 混合NHS活化的 sephr〇Se4FF，偶联上适体，制备出AAC ;再以易污染真菌毒素的不同中药 部位，不同次生代谢产物考察对柱效的影响；最后联合使用UPLC-FLR，UFLC-MS / MS等分析 仪器建立AAC净化中药中OTA的检测方法。
[0007] 技术路线图见图1
[0008] 技术要点：
[0009] (I) AAC的制备方法，按照下述步骤进行：
[0010] a. OTA适体序列的筛选：查阅文献，合成相关适体DNA序列，考察不同序列的特异 性，Apt-2对黄曲霉毒素 B1, B2的吸附性较好，对黄曲霉毒素 G1, G2及OTA也有一定的吸附， 故特异性不强，因此优先OTA特异性序列为Apt-I (5'-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGG-AGCAT CGGACA-3'），选择合适的末端修饰方法-5'端C6间隔臂氨基修饰；
[0011] OTA适体特异性图见图2
[0012] b.AAC的制备：主要包括适体复性，洗涤，偶联，封闭，洗涤，装柱。考察载体不同活 化方式（CNBr、Expoxy、NHS)，偶联pH值（6·0,7·0,8·0,9·0，10·0)，偶联时间（0，l，2,3,4， 6h)对偶联效率的影响，得到最佳偶联方式及相关参数；
[0013] 偶联条件优化见图3
[0014] c.最大吸附量考察：在最佳偶联条件下，制备6个不同批次的AAC和对照柱（未 偶联适体），确定最大吸附量，并与商业化的适体柱相比较。
[0015] 最大吸附量考察见图4
[0016] (2) AAC适用性考察：以药用部位分类选择易被霉菌污染的中药材（种子果实类、 根及根茎类、花类、叶及全草类、动物类），综合考虑中药材中所含相关次生代谢产物（糖 类、淀粉、黄酮类、生物碱类、苯丙素类等），通过计算加样回收率方式考察这些中药材及所 含成分对AAC柱效的影响，并考察AAC净化后对降低基质效应的影响。
[0017] a.种子果实类：肉豆蘧，胡椒，小茴香，酸枣仁，胖大海，桃仁，陈皮，柏子仁，莲子， 使君子，槟榔，生麦芽，决明子，薏该仁，大麥，白扁豆，杏仁，积棋子，木瓜，淡豆豉；
[0018] b.根及根茎类：甘草，姜黄，生姜，远志，半夏，郁金，人参，西洋参，当归，葛根，黄 芪，黄芩，白芍，天麻，麦冬，板蓝根，石斛，党参，延胡索，巴戟天；
[0019] c.花类：红花，菊花，金银花，槐花，金莲花，辛夷；
[0020] d.叶及全草类：淡竹叶，荷叶，桑叶，侧柏叶，银杏叶，薄荷，广藿香，芫荽，益母草， 青蒿；
[0021] e.动物类：龟板，蜈蚣，水蛭，全蝎，僵蚕，地龙，乌梢蛇，土鳖虫，鸡内金。
[0022] (3) AAC实际应用性考察-基于AAC净化建立不同分析方法检测中药中OTA :考察 不同影响因素（稀释缓冲液类型，总离子强度，PH值，体积等）对柱效的影响，获得最佳净 化参数，以AAC为净化方法，建立不同检测方法（HPLC-FLD，UPLC-FLR，UFLC-MS / MS)，并 对比其他不同前处理方法（QuEChERS，MSro，各种SPE小柱）在代表性中药中OTA的净化效 果。
[0023] 该制备方法的优点在于：适体能够与复杂基质（中药）中痕量的OTA特异性结合， 净化效果好，且精确性高、重复性好、无批次间差异、检测成本低；AAC制备过程简便易行， 生产成本低，质量稳定可控，易于实现机械化操作，能够满足工业化生产需求。
【具体实施方式】
[0024] 通过以下实施例对本发明进一步说明。以下所列举的实施例不以任何方式构成限 制。
[0025] 溶液配制：PBS :8g NaCl，I. 2g Na2HPO4,0· 2g KH2PO4,0· 2g KCl 溶解于 1000 mL 水 中（ρΗ7·0) ;BBS1:10mM Tris，120mM NaCl，5mM KCl，5mM MgCl2(pH7.5) ;BBS2:12.5mMTris， 150mM NaCl，6· 25mM KCl，6· 25mM MgCl2 ;EBS:IOmM Tris，120mM NaCl，5mM KCl(ρΗ7· 5)。运 用2M HCl和2M NaOH调节pH值。
[0026] 实施例1 :AAC的制备
[0027] (1)制备步骤：
[0028] a.适体复性：取2. 7nmol的5'氨基修饰的适体溶解于400 μ L缓冲液中（200mM Na2HP045mM MgCl2, ρΗ8· 0)，75°C 下复性 5min，室温放置 30min ;
[0029] b.洗漆：取约 200 μ L NHS-activated sephaorse4FF凝胶用 ImL HCl (ImM，ρΗ3· 0) 迅速反复洗涤5次；
[0030] C.偶联：移去多余盐酸，迅速加入复性好的适体缓冲液，调节pH至8. 0,室温摇床 震摇反应3h ;
[0031] d.封闭：反应完成后，用 3mLNa2HP04(200mM，pH8. 0)洗涤，加入 ImLTris-HCl 缓冲 液（0. 1M，pH8. 0)室温反应2h封闭剩余活性位点；
[0032] e.洗涤：用 2mL Tris-HCl 缓冲液（0. 1M，pH8. 0,含 0. 5M NaCl)和 2mL 醋酸缓冲液 (0· 1M，ρΗ4· 0,含0· 5M NaCl)先后交替洗涤5次；
[0033] f.装柱：取 ImL柱管，垫好筛板,将Binding buffer B (IOmM Tris，120mM NaCl，5mM KCl，5mM MgCl2，pH7. 5)悬浮的偶联胶装柱，至胶高度为 0· 5mL，用 0· 05% NaN3 / BB(w / v) 缓冲液冰箱4°C保存。
[0034] (2)最佳偶联条件：采用NHS活化活化的sepharose4FF在pH8. 0下与适体反应3h 为最佳偶联条件。