50mL。
[0029] 挑取斜面培养基菌种CGMCC No. 6232的菌苔接入种子培养基，25°C摇床15化pm培 养4天，得到种子液。将种子液按体积比5%的接种量接入发酵培养基，25C摇床15化pm培 养15天，得菌丝体发酵液。
[0030] 实施例2 ;麦角硫因发酵液样品的预处理
[0031] 实施例1中趟皮侧耳（Pleurotus ostrea1:us) CGMCC No. 6232菌丝体深层发酵结 束后，将菌丝体发酵液置于9(TC水浴，200巧m揽拌条件下浸提15min，将麦角硫因浸提到细 胞外。过滤，收集滤液，使用截留分子量为4kDa的超滤膜超滤，得到的超滤透过液即为高压 液相检测的待测样品。
[003引实施例3 ;麦角硫因水息液样品的预处理
[0033] 实施例1中趟皮侧耳（Pleurotus ostrea1:us) CGMCC No. 6232菌丝体深层发酵结 束后，过滤收集菌丝体，根据需要，按湿菌丝体重：水（g湿菌丝体：血水）加入1 : 15的 水，制成菌丝体的水息液。将菌丝体水息液置于85C水浴，W 30化pm揽拌浸提lOmin，将麦 角硫因浸提到水溶液中。过滤，收集滤液，使用截留分子量为4kDa的超滤膜超滤，得到的超 滤透过液即为高压液相检测的待测样品。
[0034] 实施例4 ;对照品溶液的制备
[00巧]精密称取麦角硫因对照品lOmg，于25血容量瓶中加纯水配制成浓度为400mg/L的 对照品胆备液。再精密吸取胆备液适量，加纯水制成浓度分别为40、80、120、160和200mg/ L浓度的溶液，经0. 22 y m微孔滤膜过滤，即得对照品溶液。
[003引实施例5 ;色谱条件的优化
[0037] 初始色谱检测条件：高压液相色谱（Agela LC-10F)，HILIC分析色谱柱 (250mmX4.6mm，5ym，V册 10525BXN0068)，流动相为己膳-水（85 : 15, v/v)，检测波长 254nm，柱温3(TC，流速1血/min,进样量10 y L;进样物质为实施例2和3处理得到的待测 样品溶液。
[003引（1)流动相组成的选择；分别使用相同体积的甲醇、丙丽和己醇替代己膳作为流动 相中的有机相，其他条件与初始色谱条件相同。
[0039] 检测结果；选用甲醇作有机相时，麦角硫因保留较弱，与杂质分离度差，峰型拖尾； 选用丙丽作有机相时，流动相在254nm下吸收太强，盖住样品峰；选用己醇作有机相时，麦 角硫因与杂质分离度差，样品峰型拖尾；选用己膳作有机相，麦角硫因的峰形及与杂质的分 离度均较好，故选择己膳-水作为流动相组成。
[0040] (2)流动相组成比例的选择；分别使用体积比为80 : 20、85 : 15、90 : 10和 95 : 5的己膳-水做流动相，其他条件与初始色谱条件相同。
[0041] 检测结果；采用上述的流动相比例均能实现麦角硫因与杂质的分离，己膳在流动 相中所占比例越大，麦角硫因与杂质的分离效果越好，但有机相比例过高时，麦角硫因不易 被洗脱，致使保留时间过长，不利于麦角硫因的检测分析，故选择（80~95) : (20~5)的 己膳-水（v/v)作为流动相。
[0042] (3)流动相抑的优化；使用20mmol/L的己酸馈缓冲液调节流动相的抑至5. 0、 5. 6、6. 0、6. 5、7. 0、7. 5、8. 0和8. 5,其他条件与初始色谱条件相同。
[0043] 检测结果：使用己酸馈缓冲液调节流动相的抑至5. 6~8. 0之间，麦角硫因与杂 质的分离度明显优于其他抑条件下的分离度，P册.0时分离效果最佳。pH过高或过低均不 利于麦角硫因与杂质的分离。
[0044] (4)使用 5mmol/L、10mmol/L、20mmol/L、30mmol/L、40mmol/ 和 50mmol/L 的己酸馈 缓冲液调节流动相的抑至6. 0,其他条件同初始色谱条件。
[0045]检测结果；5mmol/L的缓冲液对麦角硫因与杂质的分离效果基本无影响，盐浓度 过高则在流动相中的溶解较差。当盐浓度在lOmmol/L~40mmol/L之间较利于样品与杂 质的分离。盐浓度为20mmol/L时，麦角硫因的峰形更好，因此选择己酸馈缓冲液的浓度为 20mmol/L。
[0046] (5)使用20mmol/L的磯酸二氨钟-氨氧化轴缓冲液调节流动相的抑至6. 0、6. 5、 7. 0、7. 5和8. 0,其他条件同初始色谱条件。
[0047] 检测结果：由于流动相中己膳的浓度较高，磯酸缓冲盐在流动相中的溶解度较差， 不宜使用。
[0048] (6)使用20mmol/L的磯酸氨二轴-巧樣酸缓冲液调节流动相的抑至5. 5、6. 0、 6. 5、7. 0、7. 5和8. 0,其他条件同初始色谱条件。
[0049] 检测结果：由于流动相中己膳的比例较高，导致巧樣酸缓冲盐的溶解度较差，不宜 使用。
[0050] (7)柱温的优化；调节柱温分别为251：、301：、351：、401：和45。其他条件同初始 色谱条件。
[0051] 检测结果；上述温度均能实现麦角硫因与杂质的有效分离，但温度越低峰形越宽， 出峰时间越长。4(TC与45C条件下分离效果接近，因此选择4(TC作色谱检测的适宜柱温。 [005引实施例6 ;色谱条件优化结果
[0053] 优化后的色谱检测条件；高压液相色谱（Agela LC-10F)，HILIC分析色谱柱 (250mmX4. 6mm，5y m，V册 10525BXN0068)，流动相为己膳-水（85 : 15，v/v)，使用 20mmol/ L的己酸馈缓冲液调节流动相的抑至6. 0,检测波长254nm，柱温40°C，流速1血/min,进样 量10 y L ;进样物质为实施例2处理得到的待测样品溶液。结果见附图1。
[0054] 由附图1可见，麦角硫因达到了理想的保留效果，与杂质实现有效分离，目的峰明 显，峰形较好。
[005引实施例7 ;色谱柱重现性考察
[0056] 另选择两根规格和填料与VH510525BXN0068柱相同的HILIC分析柱 V册10525BXN0095和V册10525BXN0096,进行色谱柱重现性测试，其它色谱检测条件同实施 例6,结果见附图2、3。
[0057] 由附图1、2、3看出，H根不同的HILIC分析柱均能使麦角硫因样品达到理想的分 离效果，表明使用HILIC色谱检测麦角硫因具有条件稳定、通用性强的优点。
[005引实施例8 ;检测限和定量限实验
[0059] 使用流动相逐步稀释由实施例4制备的麦角硫因对照品溶液，进行色谱分析，色 谱条件同实施例6,在信噪比S/N为3和10时，计算得麦角硫因的最低检测限和定量限分别 为 4mg/L和 lOmg/L。
[0060] 实施例9 ;标准曲线的绘制
[0061] 将由实施例4制备得到的麦角硫因对照品溶液进行色谱检测，检测条件同实施例 6,记录色谱图，根据对照品的浓度与相应的峰面积绘制标准曲线，结果见附图4。标准曲线 用于定量测定样品中麦角硫因的含量。
[0062] 实施例10 ;精密度试验
[0063] 对由实施例2得到的1份待测样品溶液进行5次平行的高压液相色谱测定，色谱 条件同实施例6,麦角硫因含量检测结果的相对标准偏差RSD为1. 47%，表明该方法的精密 度良好。
[0064] 实施例11 ;重复性试验
[0065] 取1份麦角硫因发酵液，按照实施例2的方法平行制备5份待测样品溶液，测定麦 角硫因的含量，计算麦角硫因含量的RSD值为1. 03%，表明该方法重复性良好。
[0066] 实施例12 ;样品的时间稳定性的考察
[0067] 取实施例2处理得到的1份待测样品，在室温下分别放置0、2、4、6、8、10、14和2化 后进行测定，色谱检测条件同实施例6,结果见表1，计算麦角硫因含量的RSD值为1. 66%，表 明待测样品在2化内稳定。
[0068] 表1麦角硫因的含量随样品存放时间的变化
[0069]
【主权项】
1. 一种麦角硫因的高压液相色谱检测方法，包括采用亲水作用色谱（HILIC)分析色 谱柱对含有麦角硫因的样品进行高压液相色谱分析，所述色谱柱采用HILIC填料作为固定 相，采用（80~95 ) : (20~5 )的乙腈-水（v/v )溶液作为流动相，所述溶液的pH为5. 6~ 8.0,柱温为25~45°C。
2. 如权利要求1所述的检测方法，其中所述流动相为（85~95) : (15~5)的乙腈-水 (v/v)溶液。
3. 如权利要求1所述的检测方法，其中所述溶液的pH为6. 0~8. 0。
4. 如权利要求1所述的检测方法，其中所述柱温为30~40°C。
5. 如权利要求1所述的检测方法，其中使用10mmol/L~40mmol/L的乙酸铵缓冲液调 节所述流动相的pH至预定范围。
6. 如权利要求1所述的检测方法，其中使用10mmol/L~25mmol/L的乙酸铵缓冲液调 节所述流动相的pH至预定范围。
7. 如权利要求1所述的检测方法，其中麦角硫因的出峰时间在19min~25min，检测波 长为250~260nm。
8. -种麦角硫因的定量检测方法，包括如下步骤： 1) 麦角硫因对照品的预处理步骤，包括制备含不同浓度的麦角硫因对照品的溶液； 2) 对含不同浓度的麦角硫因对照品的溶液分别进行如权利要求1一7中任一项所述的 高压液相色谱检测； 3) 根据麦角硫因对照品的浓度与相应的高压液相色谱峰面积绘制标准曲线；和 4) 对麦角硫因待测样品进行如权利要求1一7中任一项所述的高压液相色谱检测，根 据检测结果的出峰时间和峰面积，比照麦角硫因对照品的出峰时间和标准曲线，对待测样 品中的麦角硫因的含量进行定量。
【专利摘要】本发明涉及一种麦角硫因的高压液相色谱检测方法，包括采用亲水作用色谱（HILIC）分析色谱柱对含有麦角硫因的样品进行高压液相色谱分析，所述色谱柱采用HILIC填料作为固定相，采用（80～95）∶（20～5）的乙腈-水（v/v）溶液作为流动相，所述溶液的pH为5.6～8.0，柱温为25～45℃。本发明还涉及麦角硫因的定量检测方法。
【IPC分类】G01N30-02
【公开号】CN104749263
【申请号】CN201310738112
【发明人】姜文侠, 刘琦, 王洪宇, 刘伟, 李运华
【申请人】中国科学院天津工业生物技术研究所
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2013年12月26日