呕吐毒素的均相免疫检测试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种霉菌毒素残留的免疫化学快速检测技术，具体设及呕吐毒素的均 相免疫检测试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002] 呕吐毒素最早于1970年在日本的一次赤霉病大麦中毒的病毒中发现，可引起动 物拒食和呕吐现象。呕吐毒素作为一种常见的真菌毒素，在自然界中广泛存在，主要污染 小麦、玉米等粮食作物及其制品。由于呕吐毒素较强的毒性，世界各国都高度重视对其的 监控，并制定出严格的限量标准；美国食品药品管理局（FDA)规定在小麦成品中的限量为 1000 y g/kg，欧盟规定谷粉和玉米粉中限量为750 y g/kg，我国在国家标准中规定谷物中呕 吐毒素的限量为1000 y g/kg。
[0003] 现有的呕吐毒素检测方法主要有理化方法、ELISA方法、胶体金层析法等。该些方 法各有优缺点，无法满足现场快速检测的需求。理化方法前处理过程复杂、仪器化程度高、 操作繁琐、效率低。ELISA方法经过多次洗脱过程，标记物酶易失活，底物见光易分解，环境 干扰因素复杂等缺点，且已不能满足越来越低的限量标准。胶体金层析法可W满足现场快 速的要求，但是只能定性检测无法得到定量结果。
[0004] 现有一些呕吐毒素定量检测试剂盒，如已公开专利CN 101413954A呕吐毒素的酶 联免疫吸附检测专用测试盒的制备方法、CN103823064A-种呕吐毒素定量检测试剂盒及其 使用方法，公开的试剂盒均采用是酶联免疫分析方法。酶联免疫分析方法是采用固相吸附 分离的方法，需要固相材料吸附捕获抗体-待检抗原-标记抗体，由于标记抗体为过量，所 W检测前均需要洗漆去除未参加反应的标记抗体。此时，通过检测与待测抗原结合的标记 抗体，才能与待测抗原呈正比例关系。
[0005] 固相吸附分离方法有两个重要环节；包被和洗漆。固相吸附分离方法设计巧妙，操 作简单，故应用非常广泛。但是，此种非均相反应模式因包被和洗漆环节的存在，给标记免 疫分析造成很大缺陷，主要表现在W下两个方面：
[0006] 1.在包被过程，无论物理吸附还是化学连接，包被于固相材料表面的抗体分子其 构象不同于处于液相中的抗体分子，与抗原分子结合能力因空间位阻效应将受到一定限 审IJ;无论采用微球还是微孔板作为固相材料，由于包被面积有限，捕获抗体分子不能最大限 度满足大量待测抗原的需要，由此将影响检测范围。
[0007] 2."洗板"或"洗球"是非均相免疫分析中的重要环节且多次出现。洗漆过程增加 检测程序的复杂性，增加检测时间并给实现自动化带来障碍。此外，由于洗漆过程特别是酶 免疫分析，难于实现标准化，每个测试孔之间洗漆效果不同，在一定程度上影响检测的精密 度，出现批间、批内差异。
【发明内容】
[000引本发明的目的在于提供一种呕吐毒素的均相免疫检测试剂盒及检测方法，W解决 现有检测盒中试剂种类多，其检测方法操作繁琐，检测灵敏度低的问题。
[0009] 本发明的另一个目的是提供一种呕吐毒素的均相免疫检测方法。
[0010] 为实现本发明的目的，采用W下技术方案。
[0011] -种呕吐毒素的均相免疫检测试剂盒，其包括如下试剂；受体微球、供体微球、生 物素化呕吐毒素、呕吐毒素标准品；
[0012] 其中，所述受体微球包被有呕吐毒素抗体，所述供体微球包被有链霉亲和素。
[0013] 如上所述的呕吐毒素均相免疫检测试剂盒，优选地，该检测试剂盒还包括样品稀 释液，所述样品稀释液为甲醇-PBS溶液。
[0014] 如上所述的呕吐毒素均相免疫检测试剂盒，优选地，所述受体微球的浓度为 10 y g/mL~30 y g/mU所述供体微球的浓度为10 y g/mL~30 y g/mU所述生物素化呕吐毒 素浓度为3 y g/mL~10 y g/mL。
[0015] 如上所述的呕吐毒素均相免疫检测试剂盒，优选地，所述受体微球的缓冲溶液为 含有质量百分比为0. 2% BSA，体积百分比为0. 02% Proclin-300的PBS溶液，所述生物素 化呕吐毒素的缓冲液为PBS溶液，所述供体微球的缓冲溶液为终浓度为25mM 4-哲己基嗽 嗦己横酸（肥阳巧，lOOmM化CI0.0 5% Proclin-300,抑7. 4的溶液。
[0016] 利用如上所述的呕吐毒素均相免疫检测试剂盒检测呕吐毒素的检测方法，包括W 下步骤：
[0017] 1)将所述呕吐毒素标准品配置成具有浓度梯度的标准品；
[001引 2)反应板每孔加入所述受体微球，生物素化呕吐毒素抗原；之后，分别在各孔加 入待测样品、步骤1)制备的标准品；
[0019] 如振荡，室温或37°C避光解育5min~lOmin ;
[0020] 4)每孔加入所述供体微球，振荡条件下，室温或37°C避光解育5min~lOmin ;
[0021] 5)结果读取；将反应板置于均相免疫检测仪上读数；
[0022] 6)检测结果分析：根据标准品检测的结果绘制标准曲线，将样品的检测结果对应 标准曲线，即可获得检测样品中呕吐毒素的含量。
[0023] 如果待检样品为固体时，要对样品进行前处理，提取上清液进行检测。
[0024] 如上所述的检测方法，优选地，采用80 y L反应体系，所述受体微球的加入量为 25 所述生物素化呕吐毒素的加入量为10 ^以所述样品或标准品的加入量为35 ^以所 述供体微球的加入量为10 y L。
[0025] 如上所述的检测方法，优选地，所述步骤（3)中37°C避光解育的时间为5min，所述 步骤（4)中37°C避光解育的时间为lOmin。
[0026] 如上所述的检测方法，优选地，所述步骤（6)检测结果分析包括：
[0027] a.用所获得的每个浓度的标准品溶液的巧光计数值除W呕吐毒素浓度为0的巧 光计数值再乘W 100%，得到百分巧光计数值；W呕吐毒素标准品浓度的半对数值为X轴， 百分巧光计数值为Y轴，绘制标准曲线图；
[002引 b.按步骤a所述的百分巧光计数值计算方法，计算所述待测样品的百分巧光计数 值，相对应该待测样品的百分巧光计数值，则可从标准曲线上读出所述待测样品中呕吐毒 素的含量。
[0029] 一种检测呕吐毒素的均相免疫检测方法，包括如下步骤：
[0030] 1)配置具有浓度梯度的呕吐毒素作为标准品；
[0031] 2)反应板每孔加入包被有呕吐毒素抗体的受体微球，生物素化呕吐毒素抗原；之 后，分别在各孔加入待测样品、标准品或磯酸盐缓冲液；
[003引扣振荡，室温或37 °C避光解育；
[0033] 4)每孔加入包被链霉亲和素的供体微球，振荡条件下室温或37°C避光解育；
[0034] 5)结果读取；将反应板置于均相免疫检测仪上读数；
[0035] 6)检测结果分析：根据标准品检测的结果绘制标准曲线，将样品的检测结果对应 标准曲线，即可获得检测样品中呕吐毒素的含量。
[0036] 本发明提供的呕吐毒素的均相免疫检测试剂盒，通过特异性的抗原抗体反应将纳 米微珠对极大的拉近，级联化学发光反应将信号放大，有效的提高呕吐毒素检测的精度。该 检测试剂盒中的检测试剂稳定，灵敏、准确，具备适用面广、检测范围宽、灵敏度高、特异性 强、检测通量大、线性范围较宽等优点。
[0037] 采用本发明提供的呕吐毒素均相免疫检测方法，进行呕吐毒素的检测时，操作简 单、混合后即可测定，避免了传统免疫分析中洗脱、分离等繁琐过程，一方面，有效降低了非 特异性反应的可能性W及背景噪音的影响，显著提高了分析效率和检测灵敏度；另一方面 大大缩短检测时间，并可在现场快速检测粮食谷物中的呕吐毒素残留，检测全过程控制在 20min之内，检测限符合中国及欧盟的限量标准。
[003引利用本发明提供的呕吐毒素的均相免疫检测试剂盒，进行呕吐毒素检测的灵敏度 为0. 006 y g/l，检测范围为0. 006-1000 y g/l，大大高出现有技术化ISA的检测灵敏度。
【附图说明】
[0039] 图1是本发明一优选实施例检测呕吐毒素的标准曲线。
【具体实施方式】
[0040] 本发明的呕吐毒素免疫均相检测的原理，采用抑制法检测待测样品中的呕吐毒 素。当样品中没有呕吐毒素时，反应液中的生物素化呕吐毒素抗原，与偶联有