生鲜乳中多组类兽药残留的uplc-ms/ms同时通量检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及兽药残留的检测方法，尤其涉及生鲜乳中多组类兽药残留的UPLC-MS/ MS同时通量检测方法，属于兽药残留的检测技术领域。
【背景技术】
[0002] 生鲜乳中兽药残留直接影响人体健康，目前常用的ELISA法、Delvo法等试剂盒， 虽然具有快速、方便、易于实现等优点，但其仅能作出生鲜乳中是否有兽药残留，残留是否 超标或者有哪类兽药残留的判断，而对生鲜乳中实际存在的成份、含量难以定论。
[0003] 超高效液相色谱串联质谱技术（UPLC-MS/MS)是以质谱检测器为主要识别手段， 集高效液相色谱分离过程与质谱高灵敏度、高选择过程于一体的定量分析方法。自Yamada ^ (Yamada,R. ,Kozono,M. ,Ohmori,T. ,Morimatsu,F. , &Kitayama,M. (2006).Simultaneous determinationofresidualveterinarydrugsinbovine,porcine,andchickenmuscle usingliquidchromatographycoupledwithelectrosprayionizationtandemmass spectrometry.BiosciBiotechnolBiochem, 70 (I) ,54-65.)首次报道了米用液相色谱串 联质谱技术测定牛肉、猪肉和鸡肉中多组类兽药残留后，近年来，该项技术在动物性食品中 多兽药残留分析过程中越来越受到重视和应用，不断出现一批新型多残留分析技术。但是 现有检测方法中存在兽药种类单一、前处理复杂、定量难的技术难题，亟待开发一种多组类 兽药残留同时定量分析方法。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一种生鲜乳中多组类兽药残留的UPLC-MS/MS 同时通量检测方法，通过一次前处理达到同时检测五大类38种残留兽药的目的，且灵敏度 高，检出限低。
[0005] 本发明所要解决的上述技术问题是通过以下技术方案实现的：
[0006] 本发明公开了生鲜乳中多组类兽药残留的UPLC-MS/MS同时通量检测方法，包括 以下步骤：
[0007] (1)提取待检测样品中的兽药化合物，得到提取液；（2)将提取液浓缩后，调节pH 至7. 5-10. 0,得到过柱液；(3)活化固相萃取柱；(4)过柱液上活化后的固相萃取柱，用淋洗 液淋洗固相萃取柱再用洗脱液洗脱；收集洗脱液，浓缩，复溶，用滤膜过滤后采用UPLC-MS/ MS进行定性、定量测定。
[0008] 其中，所述多组类兽药为：阿莫西林、氨苄西林、氯唑西林、苯唑西林、青霉素G、双 氯西林、萘夫西林、头孢哌酮、头孢喹咪、头孢匹林、头孢氨苄、头孢噻呋、头孢唑林、头孢洛 宁、环丙沙星、达氟沙星、恩诺沙星、氟甲喹、麻保沙星、二氟沙星、奥比沙星、沙拉沙星、磺 胺胍、磺胺吡啶、磺胺嘧啶、磺胺-6-甲氧嘧啶、磺胺甲基异恶唑、磺胺甲嘧啶、磺胺氯哒嗪、 甲氧苄氨嘧啶、多西环素、四环素、土霉素、金霉素、红霉素、林可霉素、泰乐菌素和替米考 星。
[0009] 步骤（1)中所述的提取方法包括：将待检测样品用水稀释后得到稀释液，再加入 乙腈，稀释液与乙腈的体积比为1 :2,振荡，离心，取上清液。
[0010] 步骤（2)中将提取液浓缩后，调节pH值至7. 5-8. 5,优选为8. 5 ;其中，优选采用磷 酸盐缓冲液调节PH值。
[0011] 步骤⑶中用磷酸盐缓冲液活化HLB固相萃取柱；所述磷酸盐缓冲液的pH值为 7. 5-8. 5,优选为pH8. 5。
[0012] 步骤（4)中所述的淋洗是依次用pH值为7. 5-8. 5的磷酸盐缓冲液和水进行淋洗； 优选的，依次用PH值为8. 5的磷酸盐缓冲液和水进行淋洗；所述的洗脱是依次用乙腈和水 的混合溶液、乙腈进行洗脱；优选的，乙腈和水的混合溶液中乙腈和水的体积比是1 :1。
[0013] 其中，步骤（2)和步骤（4)中所述的浓缩为氮吹法浓缩。
[0014] 步骤⑷中色谱条件为：色谱柱为UPLCBEHC18Column;流动相A为乙腈，流动相 B为0. 1 %甲酸的水溶液；流速：0. 3mL/min，柱温40°C;进样量5yL;洗脱梯度：0-0. 5min， 5 %A；0. 5-lmin,5-10%A；l-3min, 10-40%A；3-4min,40-90%A；4~4.lmin,9〇-5%A； 4. 1-6. 5min,5%A〇
[0015] 步骤（4)中质谱条件为：离子化模式：ESI+ ;检测方式：多离子反应监测模式；毛 细管电压：〇. 5KV;锥孔电压：30V;去溶剂温度：500°C;去溶剂气流速：1000L/h;载气，高纯 氮，纯度>99. 999% ;数据采集格式：分段采集。
[0016] 步骤（4)中所述的定性定量测定：定性方法是根据待检测样品与标准物质出峰时 间一致时，结合质谱参数中的定性和定量离子对确定为目标化合物；
[0017] 定量方法是根据兽药标准品浓度与峰面积绘制标准工作曲线，根据待测样品中的 目标化合物的峰面积带入标准曲线方程，计算相应浓度；
[0018] 其中，选择349和114作为阿莫西林的监测离子，349和208为定量离子；
[0019] 选择350和106作为氨苄西林的监测离子，350和174为定量离子；
[0020] 选择436和160作为氯唑西林的监测离子，436和277为定量离子；
[0021] 选择402和160作为苯唑西林的监测离子，402和243为定量离子；
[0022] 选择335和160作为青霉素G的监测离子，335和176为定量离子；
[0023] 选择470和160作为双氯西林的监测离子，470和311为定量离子；
[0024] 选择415和199作为萘夫西林的监测离子，415和171为定量离子；
[0025] 选择646和530作为头孢哌酮的监测离子，646和290为定量离子；
[0026] 选择529和134作为头孢喹咪的监测离子，529和396为定量离子；
[0027] 选择424和292作为头孢匹林的监测离子，424和152为定量离子；
[0028] 选择348和158作为头孢氨苄的监测离子，348和140为定量离子；
[0029] 选择524和241作为头孢噻呋的监测离子，524和285为定量离子；
[0030] 选择455和323作为头孢唑林的监测离子，455和295为定量离子；
[0031] 选择459和152作为头孢洛宁的监测离子，459和337为定量离子；
[0032] 选择332和314作为环丙沙星的监测离子，332和288为定量离子；
[0033] 选择358和255作为达氟沙星的监测离子，358和340为定量离子；
[0034] 选择360和316作为恩诺沙星的监测离子，360和342为定量离子；
[0035] 选择262和244作为氟甲喹的监测离子，262和202为定量离子；
[0036] 选择363和320作为麻保沙星的监测离子，363和和72为定量离子；
[0037] 选择400和356作为二氟沙星的监测离子，400和382为定量离子；
[0038] 选择396和352作为奥比沙星的监测离子，396和295为定量离子；
[0039] 选择386和342作为沙拉沙星的监测离子，386和368为定量离子；
[0040] 选择215和156作为磺胺胍的监测离子，215和108为定量离子；
[0041] 选择250和156作为磺胺吡啶的监测离子，250和184为定量离子；
[0042] 选择251和156作为磺胺嘧啶的监测离子，251和108为定量离子；
[0043] 选择281和156作为磺胺-6-甲氧嘧啶的监测离子，281和108为定量离子；
[0044] 选择254和156作为磺胺甲基异恶唑的监测离子，254和108为定量离子；
[0045] 选择279和186作为磺胺甲嘧啶的监测离子，279和156为定量离子；
[0046] 选择285和156作为磺胺氯哒嗪的监测离子，285和108为定量离子；
[0047] 选择291和230作为甲氧苄氨嘧啶的监测离子，291和261为定量离子；
[0048] 选择445和428作为多西环素的监测离子，445和321为定量离子；
[0049] 选择445和410作为四环素的监测离子，445和427为定量离子；
[0050] 选择529和134作为土霉素的监测离子，529和396为定量离子；
[0051] 选择479和154作为金霉素的监测离子，479和462为定量离子；
[0052] 选择734和158作为红霉素的监测离子，734和576为定量离子；
[0053] 选择407和126作为林可霉素的监测离子，407和359为定量离子；
[0054] 选择916和174作为泰乐菌素的监测离子，916和101为定量离子；
[0055] 选择869和174作为替米考星的监测离子，869和696为定量离子。
[0056] 本发明通过优化样品提取及净化工艺，选择ImL牛奶加0. 5mL水稀释，再加3mL 乙腈沉淀蛋白，采用氮吹的方式进行浓缩，利用磷酸盐缓冲液调节提取液pH8. 5后过HLB 柱进行纯化，HLB柱活化液和淋洗液的pH值调节为8. 5 ;色谱分离中，采用AcquityUPLC BHKL7ym，50mmX2.lmm)C18柱作为色谱分离柱，采用乙腈和0? 1 %的甲酸水溶液作为流 动相，梯度洗脱兽药分析物；质谱测定，全部兽药在正离子模式下确定定性和定量离子对， 建立多离子反应监测（MRM)方式，分段采集数据，最终建立了一套利用高效液相色谱一串 联质谱技术同时检测生鲜乳中五大类38种兽药残留的检测方法，其中包括14种0 -内酰 胺类、8种喹诺酮类、8种磺胺类、4种四环素类、3种大环内酯类和1种林可酰胺类。
[0057] 方法学验证表明，各类兽药加标回收率分别为0 -内酰胺类为67. 9-117. 5 %， 喹诺酮类为79. 3-117. 7%，磺胺类为71. 3-106. 1%，四环素类为76-115. 5%，大环内酯 类为78. 2-106. 1 %和林可酰胺类87. 7-102. 5 % ;基质标准曲线线性相关系数r2均大于 0. 99 ;各类兽药检出限分别为|3 -内酰胺类0. 3-10yg/kg，喹诺酮类0. 03-0. 6yg/kg，磺 胺类0? 03-0. 3yg/kg，四环素类0? 6yg/kg，大环内醋类0? 05-0. 6yg/kg和林可酰胺类 0. 03yg/kg，远低于中国、欧盟和CAC规定的兽药残留最大残留限量值。
[0058]利用本发明建立的生鲜乳中多组类兽药残留的UPLC-MS/MS同时通量检测方法测