一种测定尿液中可替宁含量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于尿液代谢物检验技术领域，涉及一种尿液中可替宁的测定方法。
【背景技术】
[0002] 烟碱，俗称尼古丁，是烟草的重要成分，占烟草中总生物碱的98%。烟碱是吸烟成 瘾或烟草依赖的主要因素。进入人体内的尼古丁约80%在肝脏中的细胞色素酶P4502A6的 作用下代谢为可替宁。可替宁随血液进入到人体各个部位，在血液、尿液、唾液等体液和肝 脏及脑等器官中均发现可替宁的分布。可替宁在体内的半减期为18_22h，且由于尼古丁是 可替宁的唯一来源，因此是目前公认的评价卷烟烟气暴露的特异性生物标志物。
[0003] 由于尿液具有易采集，非创伤性等特点，是生物暴露风险评估中应用最为广泛的 生物基质。尿液中可替宁的测定方法主要有：酶联免疫法、毛细管电泳化学发光法、气相色 谱质谱法、液相色谱法和液相色谱-质谱法（LC-MS/MS)。LC-MS/MS具有灵敏度高，选择性 强等特点，前期建立的LC-MS/MS法需要液液萃取或固相萃取净化尿液样本。Fan等建立了 一个直接稀释过滤进样分析尿液中可替宁的LC-MS/MS方法，此方法简化了前处理过程，选 取了一根常规的液相色谱柱（柱径：4. 6mm，粒径：5ym)，但其分离的效果不如小粒径、窄内 径的UPLC色谱柱。
【发明内容】
[0004] 鉴于此，本发明目的在于提供一种操作简便、快速、准确、灵敏度高的尿液中可替 宁含量的测定方法。
[0005] 为解决以上技术问题，本发明提供的技术方案是，提供一种测定尿液中可替宁含 量的方法，包括以下步骤：
[0006] 步骤a)
[0007] 移取尿液于离心管，加入氘代内标，用乙腈稀释；
[0008] 步骤b)
[0009] 将离心管置于涡旋振荡仪，涡旋振荡，静置；吸取上清液经有机相滤膜过滤，滤液 待测；步骤c)
[0010] 用甲醇配置可替宁标准储备液，低温避光保存；取一定量的储备液，用甲醇稀释定 容，制得可替宁工作液；
[0011] 用甲醇准确配置可替宁-d3内标储备液，用内标储备液配制内标工作液，低温避光 保存，使用前将其恢复到室温；
[0012] 用乙腈配制不同浓度的可替宁标准工作溶液；
[0013] 步骤d)超高效液相色谱-串联质谱测定
[0014] 吸取配制好的不同浓度的可替宁标准工作溶液，注入UPLC-MS/MS系统，按内标法 以峰面积计算出样品待测液中可替宁含量。
[0015] 根据本发明的一个【具体实施方式】，步骤a)中，内标浓度为IOyg/mL，加入尿液样 品、内标、乙腈的体积依次为100yL，30yL和870yL。
[0016] 根据本发明的一个【具体实施方式】，步骤b)中，祸旋振荡2min，2400转/min。
[0017] 根据本发明的一个【具体实施方式】，步骤c)中，所述低温避光保存为：选用棕色玻 璃瓶作为容器，放入_20°C保存。
[0018] 根据本发明的一个【具体实施方式】，所述步骤d)中测定尿液中可替宁含量的具体 操作为：吸取配制好的不同浓度的可替宁标准工作溶液，注入UPLC-MS/MS系统，绘制可替 宁的线性回归方程，对纯化稀释后的样品待测液进行测定，测得分析物与内标峰面积的比 值，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量。
[0019] 根据本发明的一个【具体实施方式】，所述UPLC-MS/MS系统的测定条件中：
[0020] 色谱条件：选用色谱柱AtiantisUPLCBEHShieldRPC18,规格为 50mmX2. 1mm， I. 7ym;流动相A:体积分数为0.I%的甲酸水溶液，流动相B:0.I%甲酸甲醇溶液；流速 0. 8mL/min，柱温35°C，进样量5yL;梯度洗脱；
[0021] 根据本发明的一个优选实施方式，所述梯度洗脱条件：〇~Imin, 98%A~98%A; 1. 1 ~3.Omin，2%A~2%A;3. 01 ~4.Omin, 98%A~98%A。
[0022] 根据本发明的一个【具体实施方式】，所述UPLC-MS/MS系统的测定条件中：
[0023] 质谱条件：电喷雾离子源，喷雾电压（IS) 2. 6kV;离子化温度350°C;雾化气流量 1000L/Hr;锥孔气流量50L/Hr;碰撞气流量为0. 15ml/min;碰撞气为氩气，其余气体为氮 气；驻留时间为30msec，正离子MRM模式采集，选取m/z177. 2/98. 0作为定量离子对，m/z 177. 2/80. 1为确认离子对，m/z180. 2/80. 1为对应的氘代内标离子对。
[0024] 根据本发明的一个【具体实施方式】，所述尿液为冷冻保存尿液，测定前在室温下解 冻。
[0025] 与现有技术相比，上述技术方案中的一个技术方案具有如下优点：
[0026] 1、与传统的气相色谱-质谱法比较，本发明采用乙腈直接稀释，涡旋振荡过滤进 样的方式，简化了前处理过程，提高了分析灵敏度。
[0027] 2、由于选取了超高效液相色谱柱，使得柱子的分离度明显提高，分析时间显著缩 短，提高检测通量。串联质谱的使用使得方法的选择性和灵敏度提高，更有利于非吸烟者或 二手烟接触者尿液中低含量可替宁的测定。
[0028] 3、选取了乙腈稀释与沉淀尿液中蛋白方法，氘代内标定量，有效消除基质干扰和 前处理过程中引起的误差。
[0029]4、本方法具有操作简便、快速、准确、灵敏度及重复性好的优点。
【附图说明】
[0030] 图1是本发明一较佳实施例的尿液样品中可替宁的选择离子流色谱图。
[0031] 图2是本发明一较佳实施例的尿液样品中氘代可替宁的选择离子流色谱图。
【具体实施方式】
[0032] 下面结合一个具体实施例进行说明。
[0033] 本实施例中尿液中可替宁含量的测定方法，依次采用乙腈稀释与沉淀蛋白，氘代 内标定量，涡旋振荡净化，有机相滤膜过滤，超高效液相色谱-串联质谱仪测定，可快速、准 确、同时检测出、尿液中可替宁的含量。
[0034] 本实施例所用仪器和试剂为：
[0035] WatersXevoTQ超高效液相色谱-串联质谱仪（美国Waters公司），配备电喷雾 电离源（ESI);VtexMixer230VeU振荡器（美国Labnet公司）。
[0036]甲酸为HPLC级（浓度为49-51 %，德国Sigma公司）；乙腈、甲醇均为色谱纯（美 国Thermo-Fisher公司）；可替宁，可替宁_d3(纯度：98 % ;同位素纯度：99%，Toronto ResearchChemicalsInc. )〇
[0037] I、提取尿液中的分析物
[0038] 取冷冻尿液样品，于室温下解冻，混合均匀后，取100yL的尿液并加入30yL的氘 代内标，加入870yL乙腈，在2400转/分钟的条件下涡旋振荡2min。上清液过0. 22ym有 机相滤膜，取5yL滤液用于LC-MS/MS分离分析。
[0039]2、UPLC-MS/MS测定
[0040] (I)UPLC-MS/MS条件：
[0041] 色谱条件：AtiantisUPLCBEHShieldRPC18(50mmX2. 1mm，I. 7um，美国Waters 公司）；流动相A:体积分数为0.I%的甲酸水溶液，流动相B:0.I%甲酸甲醇溶液；流速 0? 8mL/min，