流感中的风险分层的制作方法
【专利说明】流感中的风险分层 发明领域
[0001] 本发明涉及用于鉴定在患有或被怀疑患有流感的患者中的临床风险的方法。本发 明还涉及用于区分患有流感或病毒性肺炎的患者和具有症状上类似的状况的患者的方法。 本发明的所述方法包括在来自患有或被怀疑患有流感的患者的生物样品中确定干扰素α 可诱导蛋白27 (IFI27)的表达水平。本发明还提供了包含适合实施所述方法的组分的试剂 盒。本发明允许将患者分层为界定临床风险的组，例如基于所述受试者长期健康的风险严 重性的组。
[0002] 发明背景
[0003] 已经报道流感/肺炎在美国前十位死因中排名第八位。流感病毒感染代表了每年 在全球范围影响人数最多的最常见传染病。流感以季节性流行的方式在全球范围内快速蔓 延，并造成相当大的住院负担。尽管难以进行全球性评估，世界卫生组织（WHO)估计每年的 流行病发病率在3-5百万危重病例之间，死亡率在每年全球250, 000-500, 000例死亡之间。 在美国，WHO已经估计流感流行影响5-15%的美国人口患有上呼吸道感染，住院和死亡主 要是高风险组（如老年人和慢性病患者），并且对美国经济造成每年US$710-1670亿的相应 成本。在发达国家中，来自流感的大多数死亡发生于超过65岁的老年人中。感染的流行以 及患者遭受的潜在严重程度，以及相应的经济成本，已经使得对它们的检测和治疗成为健 康护理系统的优先事项。
[0004] 从临床角度来看，不能鉴定患有具有较高风险发展成严重疾病的流感感染患者， 延迟了适合这类高风险患者的治疗的给予，并且对所述患者的康复和长期健康具有深远的 影响。在发展成为严重疾病的患者中，在文献中已经一直报道5-7天的平均延迟。在具有 发展成严重疾病风险的患者中避免治疗延迟是至关重要的，因为及时给予重症监护治疗与 降低流感死亡的风险有关。例如，最近有报道说，从症状发作到住院延迟一天增加5. 5%的 (HINl)流感死亡的风险\
[0005] 通常情况下，仅凭临床背景（例如，流感样症状的历史）而怀疑流感感染，并且所 述个体在没有任何正式实验室测试的情况下用抗病毒药物进行治疗。因此，临床决策并不 是必须与所述个体是否具有流感病毒有关，而是所述个体是否应当允许住院或安全地返回 家中。在这样的背景下，针对流感病毒存在的诊断测试可能是多余的。相反，临床医生需要 一个测试，可以帮助他们量化患者会如何充分地应答流感感染，其最终确定疾病严重程度。 所述疾病严重程度越严重，所感染的受试者越有可能变得恶化，并因此需要住院。
[0006] 目前，也有一些实验室方法，可以可靠地评估流感感染的严重程度。评估流感感染 的严重程度的方法一个例子涉及测试气道样品中的病毒载量（load)，作为已被认为是与疾 病的严重程度有关的流感病毒复制的程度。但是，对于气道和血清样品的研宄已经显示，无 论疾病的严重程度如何，病毒载量是相同的 2'12。这证实流感感染的严重程度并不必然与表 现为感染结果的疾病严重程度相关。
[0007] 因此，由于各种理由，尽管诊断测试可以确定流感病毒的存在或不存在并因此可 以协助临床医生，它们可能仍然不足以对临床决策产生影响，因为病毒的存在并不总是等 同于可能是感染患者中疾病进展的真正原因的异常免疫应答。
[0008] 为了给患有确认的流感感染的个体或有流感感染症状的个体提供及时和适当的 治疗，需要评估疾病严重程度或由于该感染造成的潜在的疾病严重程度的特异性测试。这 样的严重程度分层工具将协助这样的患者的管理。它允许临床医生鉴定能够安全地出院回 家的患者，同时那些被鉴定患有更加严重的疾病的或者具有发展成更加严重的疾病的较高 风险的患者被允许住院以进一步观察和治疗。它还给医生机会，采用预防措施阻止或减缓 在可以仅有轻微的症状但有可能发展成严重疾病的患者中的疾病进展。
[0009] 存在对用于评估患有或被怀疑患有流感的个体以协助提供预后和诊断信息来帮 助制定临床决策的改进方法的需要。
[0010] 发明概述
[0011] 本发明人已经认识到，在患者显示任何严重疾病的指征之前，能够区分可能需要 医院或临床环境的医疗介入的流感患者和可能安全地返回家中的流感患者（不管他们已 被确认和/或有症状）的方法，将大大有助于医生制定更好的治疗决策。
[0012] 本发明是基于（至少部分基于）发明人的所述鉴定，其中受试者中的干扰素α可 诱导蛋白27 (IFI27)基因的表达水平与该受试者中流感感染所引起的疾病严重程度相关。 该相关性可以用于在所述受试者具有流感感染症状或具有严重疾病症状之前，预测受试者 中从感染引起的疾病的严重程度。本发明涉及用于在流感感染过程中检测所述宿主应答的 特定方面的方法，其可以表示患者的不充分的应答和发展成需要医院或临床环境的医疗介 入的严重疾病的可能性。在实施方案中，本发明的所述方法可以被用于评估患有流感感染 的患者，以确定哪些个体具有临床风险（成为那些很可能发展成由所述感染引起的严重疾 病的个体），其特征在于需要医疗介入（如住院或者甚至生命支持治疗）。
[0013] 本发明应用于健康护理中，如在流感感染的早期管理中，在监测患者对所述感染 的免疫应答中，以及在给处于风险中的个体（其可能被传统诊断方法以其它方式错过）提 供拯救生命的介入中。本发明人构想，在呈现给医生手术或住院的怀疑患有流感感染的患 者中，IFI27基因表达水平能协助临床医生预测患者是否能够安全地出院回家或是否需要 住院。在这种情况下，IFI27表达的正常水平可以表示患者或者没有患有流感或者患有流 感但不具有发展成严重疾病的较高风险，在这种情况下，他们可以出院。但是，IFI27表达 上调的水平可以表示患者患有流感感染并且具有发展成严重疾病的较高风险，在这种情况 下，所述患者可能需要医院或临床环境的医疗介入。
[0014] 例如，对于医生的手术患者可能呈现怀疑患有流感感染，以及相对轻微的感染症 状，其通常导致患者被以最少的药物治疗送回家中。但是，本发明可以用于确定患者是否具 有临床风险，在这种情况下，治疗医师能够在早期介入，并且在所述感染表现为严重疾病之 前将所述患者收治入院，以进行监测和治疗。
[0015] 在另一个例子中，患者可以在医院并被确认患有流感感染，并可以显示出与严重 疾病的发展一致的一些症状。通常情况下，这可能会导致病人被送进医院治疗。然而，本发 明可用于预测患者是否实际上是可能发展成作为流感感染结果的严重疾病，这可以协助临 床医生适当分配工作人员和资源。因此，本发明可以防止过度管理所述患者，其中患者被预 测为不具有临床危险，也不会发展成作为所述感染结果的严重疾病。
[0016] 在又一个例子中，本发明人构想，在流感流行或大流行时，当难以确定个体是否感 染流感且临床资源需要被保留用于临床风险的患者时，本发明可以提供有用的筛选工具。 在这些情况下，本发明可以被用于筛选可能显示或可能不显示任何流感感染迹象的个体或 个体的组，以确定他们是否具有发展成作为流感感染结果的严重疾病的临床风险。在筛选 过程中，IFI27表达的正常水平可以表示患者或者没有患有流感或者确实患有流感并且不 具有发展成严重疾病的较高风险，在这种情况下，他们的监测或治疗可以降低优先级。但 是，IFI27表达上调的水平可以表示患者患有流感感染并且具有发展成严重疾病的较高风 险，因而具有临床风险的患者，在这种情况下，所述患者可能被进一步监测和治疗。
[0017] 类似地，本发明人构想，在由于流感感染住院的患者中，IFI27基因表达可以协助 临床医生预测患者的免疫应答的充分性，以及患者是否会进一步恶化或康复。在预测所述 患者会进一步恶化的情况下，可以给所述患者实施合适的治疗方案（protocol)，如进入重 症监护病房。可选地，所述患者有可能康复的判定会允许患者留在标准医院病房，而不是可 能占用重症监护病房中的有用资源。本发明人构想，IFI27基因表达水平还可以被用于协 助临床医生不断监测患者，例如在抗病毒治疗或与所述患者状况的治疗相关的其它护理之 后。
[0018] 在实施方案中，本发明提供基因表达测定以测量被怀疑具有流感感染的个体中 IFI27的mRNA表达水平。高水平的IFI27基因表达表明免疫去补偿（decompensating)的 风险显著增加，因而警告医生患者的临床状况即将恶化。IFI27基因表达的测量通过精确地 区分能够安全地出院回家的个体和呈现发展成严重疾病的临床风险并需要住院的个体，从 而协助医生制定他们的临床决策（即，风险分层）。因此，在流感流行和大流行过程中，本发 明在患者的初始分诊中也具有实际用途。
[0019] 在一个方面，本发明提供用于鉴定在患有或被怀疑患有流感的患者中临床风险的 方法，所述方法包括确定在来自所述患者的生物样品中干扰素α可诱导蛋白27 (IFI27)基 因的表达水平，以及将所确定的IFI27基因产物的水平与标准水平进行比较。
[0020] 在一个实施方案中，所述患者患有或被怀疑患有甲型流感或乙型流感感染或其亚 型感染。在一个实施方案中，所述亚型是甲型流感的季节性毒株。在一个实施方案中，所述 亚型是乙型流感的季节性毒株。
[0021] 在一个实施方案中，IFI27基因产物的标准水平表示没有临床风险，并且在所述患 者样品中与所述标准水平相比升高的IFI27基因产物的水平表示在所述患者中有临床风 险。
[0022] 在一个实施方案中，所述表示没有临床风险的标准水平是基于健康受试者中的 IFI27的水平。
[0023] 在一个实施方案中，所述标准水平是基于感染流感病毒但无症状的受试者中 IFI27的水平，并且在所述患者样品中与所述标准水平相比升高的IFI27基因产物的水平 表示在所述患者中的临床风险。
[0024] 在一个实施方案中，所述IFI27基因产物的标准水平表示有临床风险，并且在所 述患者样品中与所述标准水平相比相等或升高的IFI27基因产物的水平表示在所述患者 中的临床风险。
[0025] 在一个实施方案中，所述标准水平是在确定在来自所述患者的生物样品中IFI27 基因的表达水平的同时进行制备的。
[0026] 在一个实施方案中，相比基于健康受试者或感染流感病毒但无症状的受试者的标 准水平，IFI27基因产物水平为至少40-60倍表示有临床风险。
[0027] 在一个实施方案中，相比基于健康受试者或感染流感病毒但无症状的受试者的标 准水平，IFI27基因产物水平为至少60倍表示有临床风险。
[0028] 在一个实施方案中，所述标准水平是通过将IFI27基因产物的一个或更多个已知 样品经受与用于确定在来自所述患者的生物样品中的IFI27基因表达水平的相同方法进 行制备的，其中所述IFI27基因产物的一个或更多个已知样品具有表示临床风险的预先确 定的量，并且在所述患者样品中与所述标准水平相比具有相等或升高的IFI27基因产物的 水平表示在所述患者中有临床风险。
[0029] 在一个实施方案中，所述标准水平是通过将IFI27基因产物的一个或更多个已知 样品经受与用于确定在来自所述患者的生物样品中的IFI27基因表达水平的相同方法进 行制备的，其中所述IFI27基因产物的一个或更多个已知样品具有表示没有临床风险的预 先确定的量，并且在所述患者样品中与所述标准水平相比具有升高的IFI27基因产物的水 平表示在所述患者中有临床风险。
[0030] 在一个实施方案中，本发明提供监测患有流感的患者的进展的方法，所述方法包 括确定来自所述患者的第一生物样品中IFI27基因的表达水平，以及确定来自所述患者的 第二生物样品中IFI27基因的表达水平，其中所述第一和第二样品是在不同的时间从所述 患者获得的，并且基于在所述第一和第二样品中IFI27的相对表达水平评估患者的状态。 在一个实施方案中，与所述第一生物样品相比在所述第二生物样品中IFI27基因的表达水 平升高表示在所述患者中具有增加的临床风险。在一个实施方案中，与所述第一生物样品 相比在所述第二生物样品中IFI27基因的表达水平下降表示在所述患者中具有降低的临 床风险。
[0031] 在另一个方面，本发明提供用于在患者中鉴定流感或病毒性肺炎的方法，所述方 法包括确定在来自所述患者的生物样品中干扰素α可诱导蛋白27(IFI27)基因的表达水 平，以及将所确定的IFI27基因产物的水平与IFI27基因产物标准水平进行比较。
[0032] 在一个实施方案中，所述IFI27基因产物的标准水平是基于健康受试者中IFI27 的水平，并且在所述患者样品中与所述标准水平相比升高的IFI27表达水平表示在所述患 者中患有流感或病毒性肺炎。
[0033] 在一个实施方案中，所述患者被怀疑患有病毒性肺炎或细菌性肺炎。
[0034] 在一个实施方案中，本发明提供用于鉴定流感或病毒性肺炎的方法，其中所述标 准水平是基于患有细菌性肺炎的受试者中的IFI27基因产物的水平，并且在所述患者样品 中与所述标准水平相比升高的IFI27基因产物的水平表示在所述患者中患有流感或病毒 性肺炎。
[0035] 在一个实施方案中，相比基于健康受试者或患有细菌性肺炎的受试者的标准水 平，IFI27基因产物水平为至少10倍表示患有流感或病毒性肺炎。
[0036] 在一个实施方案中，相比基于健康受试者或患有细菌性肺炎的受试者的标准水 平，IFI27基因产物水平为至少40-60倍表示具有流感或病毒性肺炎和临床风险的患者。
[0037] 在一个实施方案中，相比基于健康受试者或患有细菌性肺炎的受试者的标准水 平，IFI27基因产物的水平为至少60倍表示具有流感或病毒性肺炎和临床风险的患者。
[0038] 以下实施方案适用于本文所述的本发明的所有方面。
[0039] 在一个实施方案中，所述方法进一步包括确定在所述生物样品中至少一个另外的 基因的表达水平。在一个实施方案中，所述至少一个另外的基因是其表达为组成型的基因。 在一个实施方案中，所述至少一个另外的基因是其表达不被流感感染影响的基因。在一个 实施方案中，所述至少一个另外的基因是GAPDH基因。
[0040] 在一个实施方案中，所述生物样品是血液或其组分如血细胞亚群。在一个实施方 案中，所述生物样品包含白细胞的亚群。
[0041] 在一个实施方案中，所述方法包括处理来自所述患者的血液样品，以富集浆细胞 样树突细胞（PDCs)的存在。
[0042] 在一个实施方案中，所述方法包括将所述生物样品和能够与IFI27基因产物结合 的药剂（agent)接触，并且检测所述药剂和所述IFI27基因产物之间的结合。
[0043] 在一个实施方案中，所述生物样品是RNA、mRNA或蛋白质。
[0044] 在一个实施方案中，所述IFI27基因产物是IFI27 mRNA或其片段。在一个实施方 案中，所述IFI27基因产物包含SEQ ID NO :1的核酸序列或其片段或变体。在一个实施方 案中，所述IFI27基因产物包含SEQ ID NO :2的核酸序列或其片段或变体。在一个实施方 案中，所述IFI27基因产物是同种型（isoform) 1转录变体。在一个实施方案中，所述IFI27 基因产物是同种型2转录变体。
[0045] 在一个实施方案中，所述IFI27基因产物是IFI27多肽或其片段或变体。在一个 实施方案中，所述IFI27基因产物包含SEQ ID NO :3的氨基酸序列或其片段或变体。在一 个实施方案中，所述IFI27基因产物包含SEQ ID NO :4的氨基酸序列或其片段或变体。
[0046] 在一个实施方案中，所述方法包括mRNA反转录为cDNA。在一个实施方案中，所述 IFI27 cDNA序列包含SEQ ID N0:5的序列或其片段或变体。在一个实施方案中，所述IFI27 cDNA序列包含SEQ ID NO :6的序列或其片段或变体。在一个实施方案中，所述方法包括扩 增所述样品的IFI27核酸序列（如cDNA序列）和检测所扩增的序列。在一个实施方案中， 所述扩增包括聚合酶链式反应（PCR)。在一个实施方案中，所述聚合酶链式反应包括定量聚 合酶链式反应（qPCR)。在一个实施方案中，所述聚合酶链式反应利用能够扩增选自以下的 核酸序列的一个或更多个引物：（i)SEQ ID N0:1，（ii)SEQ ID N0:2，（iii)SEQ ID N0:5， (iv) SEQ ID NO :6,和（V)或 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6 中任 意一个的片段或变体。
[0047] 在一个实施方案中，所述聚合酶链式反应利用SEQ ID NO : 7 (acctcatcagcagtgaccagt)和 SEQ ID NO :8 (acatcatcttggctgctatgg)的引物序列中的一 个或两个，或其能够扩增相同靶序列的序列变体。在一个实施方案中，所述聚合酶链式反应 可以利用 SEQ ID N0:9(TGCCTCGGGCAGCCT)和 SEQ ID N0:10(TTGGTCAATCCGGAGAGTCC)的引 物序列中的一个或两个，或其能够扩增相同靶序列的序列变体。
[0048] 在一个实施方案中，所述方法包括将所述样品与能够特异性结合IFI27基因产物 或其片段或变体的一个或更多个探针接触。在一个实施方案中，所述一个或更多个探针是 包含以下序列的核酸：（i)与SEQ ID NO :1所示的序列互补的序列，或（ii)与SEQ ID NO : 2所示的序列互补的序列，或者（i)或（ii)的片段或变体。在一个实施方案中，所述一个或 更多个探针是包含以下序列的核酸：（i)与SEQ ID NO :5所示的序列互补的序列，或（ii) 与SEQ ID NO :6所示的序列互补的序列，或者⑴或（ii)的片段或变体。在一个实施方案 中，所述核酸探针包含10-50个碱基。在一个实施方案中，所述核酸探针包含30-600个碱 基。
[0049] 在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：（i)从患有或被怀疑患有流感感染 的患者获取血液样品；（ii)从所述血液样品制备总RNA分离物；（iii)通过所述总RNA分 离物的反转录制备cDNA ; (iv)通过聚合酶链式反应扩增IFI27核酸序列；(V)将所述扩增 的IFI27核酸序列的水平与标准进行比较；(vi)基于所述比较确定所述患者是否具有临床 风险。在一个实施方案中，所述聚合酶链式反应是定量聚合酶链式反应。在一个实施方案 中，所述标准可以是基于表示有临床风险的或者表示没有临床风险的IFI基因产物的标准 水平。
[0050] 在一个实施方案中，所述方法包括确定IFI27多肽或其片段的水平。在一个实施 方案中，所述方法包括确定IFI27多肽的水平，所述IFI27多肽包含：（i)SEQ ID N0:3的氨 基酸序列，或（ii) SEQ ID NO :4的氨基酸序列，或者（i)或（ii)的抗原片段或变体。在一 个实施方案中，所述方法包括将所述样品和能够与包含SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4所示 的氨基酸序列或其抗原片段或变体的IFI27多肽选择性地结合的抗体接触。
[0051] 在一个实施方案中，所述方法包括凝胶电泳、核酸测序和氨基酸测序中的一个或 更多个。
[0052] 在一个实施方案中，所述方法完全在离体（ex vivo)进行。在一个实施方案中，将 在生物样品中确定的IFI27基于产物的水平与标准水平进行比较是在计算机程序的协助 下完成的。在一个实施方案中，基于所述比较给患者分配临床风险是在计算机程序的协助 下完成的。
[0053] 在第二个方面，提供用于确定在生物样品中干扰素 α可诱导蛋白27 (IFI27)基因 产物的水平的试剂盒，所述试剂盒包含用于检测IFI27基因产物的存在的至少一种药剂。
[0054] 在一个实施方案中，所述至少一种药剂是引物、抗体或探针。在一个实施方案中， 所述引物或探针对选自以下的核酸序列具有特异性：SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6所示的序列，或者其变体或片段。在一个实施方案中，所述试剂盒包含 能够选择性扩增选自以下的核酸序列的正向和反向引物：SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6所示的序列，或者其变体或片段。
[0055] 在一个实施方案中，所述试剂盒包含选自以下的一种或更多种核酸序列：SEQ ID NO :7(acctcatcagcagtgaccagt)、SEQ ID NO :8(acatcatcttggctgctatgg)、SEQ ID NO : 9 (TGCCTCGGGCAGCCT)和 SEQ ID NO : 10 (TTGGTCAATCCGGAGAGTCC)，或者其能够特异性结合相 同靶序列的序列变体。
[0056] 在一个实施方案中，所述试剂盒包含能够检测生物样品中干扰素 α可诱导蛋白 27 (IFI27)基因产物的存在的多种药剂。
[0057] 在一个实施方案中，所述试剂盒包含能够特异性结合由IFI27基因序列编码的多 肽或其片段或变体的抗体。在一个实施方案中，所述抗体对IFI27具有特异性的缀合抗体。 在一个实施方案中，所述抗体是多克隆抗体。在一个实施方案中，所述多克隆抗体是兔多克 隆抗体。在一个实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。在一个实施方案中，所述抗体结合至 该表位序列：MEASALTSSAVTSVAKVVRVASGSAVVLPLARIATVVIGGVVAVPMVLSAMGFTAAGIASSSIAAK MMSAAAIANGGGVASGSLVATLQSLGATGLSGLTKFILGSIGSAIAAVIARFY。
[0058] 在一个实施方案中，所述抗体能够选择性地结合至：（i)包含SEQ ID NO :3所示的 氨基酸序列的IFI27多肽，或（ii)包含SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列的IFI27多肽，或 者（iii) (i)或（ii)的抗原片段或变体。
[0059] 在一个实施方案中，所述试剂盒包含用于所述方法的标准化的一种或更多种药 剂。在一个实施方案中，所述用于标准化的药剂选自用于组成型表达的基因产物的检测的 一种或多种药剂。在一个实施方案中，所述组成型表达的基因产物是GAPDH。
[0060] 在一个实施方案中，所述试剂盒包含一种或更多种校准标准，其中所述标准包含 已知浓度的IFI27基因产物。在一个实施方案中，所述已知浓度的IFI27基因产物是表示 具有可以忽略不计的来自流感感染的严重疾病的临床风险的个体的量，或表示处于来自