的提取 取人全血2ml，加入8ml裂解液（0.1 mM EDTA)，处理15min以破碎红细胞，3000rpm离心 lOmin，弃上清，收集沉淀即是白细胞，用生理盐水洗涤白细胞两次，3500rpm离心5min，弃 上清，收集白细胞沉淀。向沉淀加入5ml细胞悬浮液（0. 25MSucrose，5mMHEPES，0. 5mM EGTA，pH7. 4)悬浮细胞，用玻璃匀浆器匀浆20次，匀浆液经1000 g离心10分钟，弃沉淀，收 集上清；上清于1000 Og离心10分钟，弃上清，收集沉淀即为线粒体，线粒体可在-80°C条件 下保存。
[0036] 实施例二 线粒体呼吸链超复合物NCR粗酶液的制备 将实施例一制得的线粒体用悬浮介质（内含0.25M Sucrose, 5mM HEPES, 0.5mM EGTA, pH7. 4)悬起，然后超声，超声10s，间歇10s，共超声10次处理，然后用BCA法定蛋白浓度为 0. 5ug/ul，该悬浮液即为含有呼吸链超复合物NCR的粗酶液，定好浓度后放于4°C环境中待 用。
[0037] 实施例三 人外周血白细胞线粒体NCR的酶活性测定 本实施例的线粒体NCR检测试剂为双剂试剂，包括 试剂1 磷酸缓冲液（PH7.2) 50mmol/L Tween 20 0.1% NADH 0.lmmol/L 氧化型细胞色素C 0. lmmol/L 试剂2 鱼藤酮 0.02mmol/L 被测线粒体NCR的样品实施例二中制得的含线粒体呼吸链超复合物NCR的粗酶液，粗 酶液用量为l〇ug，反应体系200ul。本检测方法采用酶动力学法检测线粒体NCR。
[0038] 总活性测定：将试剂1置于30°C环境中温浴3分钟，然后将试剂1加入到酶标仪 中，30°C条件下于550nm进行基线扫描1分钟，加入蛋白样品启动反应，扫描吸光值的变化， 扫描时间为180秒，记录曲线变化，计算反应的斜率。
[0039] 非特异活性测定：将试剂1与试剂2提前混合均匀后置于30°C环境中温浴3分钟， 然后将试剂混合液加入到酶标仪中，30°C条件下于550nm进行基线扫描1分钟，加入蛋白样 品启动反应，扫描吸光值的变化，扫描时间为180秒，记录曲线变化，计算反应的斜率。线粒 体NCR的酶活力可以从反应曲线的斜率的大小变化就看出来，我们给的酶活力单位为：每 分钟每克蛋白转化底物的纳摩尔数。通过还原型细胞色素C的消光系数可以将计算得到的 还原型细胞色素C的特异吸光值转化成产物还原型细胞色素C的浓度，根据蛋白用量和反 应时间可计算NCR酶活性水平。
[0040] 线粒体NCR特异性酶活力=总活性一非特异性活性 实施例四 脓毒症外周血白细胞线粒体NCR酶活性检测应用于严重脓毒症的诊断、 疾病程度监测和预后评估 以经临床确诊的脓毒症患儿为研宄对象，以年龄性别相匹配的健康志愿者为对照，采 用实施例一、二和三所描述的方法，提取2组外周血白细胞中的线粒体后，对上述样品进行 线粒体NCR酶活性测定，每个样本分别进行3次独立的测定实验，结果显示：样本的NCR测 定实验结果稳定（CV值均小于5%)，其中脓毒症患者外周血线粒体NCR酶活性水平与对照组 存在显著差异，仅为对照组的60%左右，而脓毒症死亡组与存活组的外周血线粒体NCR酶活 性水平之间存在显著差异。其余酶复合物活性中脓毒症与对照组相比基本无差异(见表1)。 可见本发明提供的外周血白细胞线粒体NCR酶活性的检测方法和试剂稳定、特异、可靠，可 应用于临床检测与线粒体NCR酶活性异常相关的疾病。线粒体NCR酶活性水平与脓毒症的 病情严重程度与预后情况存在明显的正相关性，因此，线粒体NCR酶活性水平可以作为严 重脓毒症诊断、疾病危重程度监测及预后评估的标志物。
[0041] 表1_线粒体呼吸链超复合物NCR检测结果_1_1
【主权项】
1. 一种从线粒体水平诊断脓毒症、监测危重程度和评估预后的方法，其组成为：脓毒 症患者外周血白血细胞中线粒体呼吸链超复合物NADH-细胞色素C氧化还原酶（NADH: cytosomeCoxidoreductase，NCR)的酶活性水平；线粒体NCR酶活性下降用于脓毒症的诊 断、危重程度的监测和不良预后的评估。
2. 如权利要求书1所述的方法，其中线粒体NCR功能水平是通过检测其酶活力来确定 的，该酶活性检测的原理为：NCR在特定条件下催化将NADH中的电子转移给电子受体辅酶 Q，生成还原型辅酶Q进一步将电子转移给氧化型细胞色素C生成还原型细胞色素C;还原 型细胞色素C在特定波长下具有特异的光吸收，在特定条件下可检测到还原型细胞色素C 的光吸收值，由于NCR催化底物的反应速率与还原型细胞色素C的生产量成正比，因此，检 测还原型细胞色素C的吸光值，就可以计算出NCR的酶活性水平。
3. -种NCR酶活性检测试剂，其特征在于：它是根据权利要求书2所述的原理和方法 来开发配制的，它主要用于NCR活性分析和检测。
4. 如权利要求书3所述的NCR酶活性检测试剂，其特征在于：其主要成分包括如权利 要求书2所述的电子受体氧化型细胞色素C和电子供体NADH，这种检测试剂主要用于NCR 的酶活性的分析和检测。
5. 如权利要求书3-4所述的NCR酶活性检测试剂，其特征在于：其成分中还可以包括 抑制剂，这种抑制剂是在酶学上普遍被接受的各种能够抑制NCR酶活力的试剂或分子。
6. 如权利要求书3-4所述的NCR酶活性检测试剂，其特征在于其成分还可以包括缓冲 液和稳定剂，所述的稳定剂是被物理、化学和酶学上普遍接受和使用的各种表面活性剂；所 述的缓冲液中的缓冲试剂是被物理、化学和酶学上普遍接受的能将体系的PH值缓冲或稳 定5. 0-9.0的范围中的试剂。
7. -种NCR酶活性检测试剂，其特征在于：它是基于权利要求书1-6所述的原理、方法 和试剂的基础上开发配制的，其主要成分包括： 如权利要求书6所述的缓冲液 10-lOOOmmol/L pH范围 5.0 - 9.0 如权利要求书6所述的稳定剂 0. 01% - 10% NADH 0. 01-lOmmol/L 如权利要求书5所述的抑制剂 0 - 20mmol/L 氧化型细胞色素C 0. 005-lmmol/L 该检测试剂主要用于NCR的酶活性分析和检测。
8. 根据权利要求7所述线粒体NCR酶活性检测试剂，其特征在于：由缓冲液、稳定剂、 NADH、抑制剂、氧化型细胞色素C组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、NADH、氧化型细 胞色素C组成；试剂2,由抑制剂组成。
9. 根据权利要求8所述线粒体NCR酶活性检测试剂，其特征在于：由缓冲液、稳定剂、 NADH、抑制剂、氧化型细胞色素C组成三剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、NADH组成；试剂 2,由缓冲液、稳定剂、氧化型细胞色素C组成；试剂3,由抑制剂组成。
10. 如权利要求书2-9所述的线粒体NCR酶活性测定的方法和试剂，其特征在于，这种 检测方法和试剂可以用于分析和检测各种待测样本中的线粒体NCR酶；特别是可以用于分 析和检测人体的各种体液、组织和细胞样本中的线粒体NCR酶活性；也可以用于分析和检 测完整细胞、已破碎细胞、完整线粒体和已破碎线粒体中的NCR酶活性。
11. 如权利要求书2-9所述的线粒体NCR酶活性检测的方法和试剂，其特征在于，这种 检测方法和试剂可以用于分析、检测和诊断与线粒体NCR酶活性异常导致的各种疾病。
12. 如权利要求书1-10所述的方法和试剂，其特征在于，这种检测方法和试剂可以用 于诊断脓毒症、多器官功能障碍的判定、监测危重程度和评估预后。
13. 如权利要求书1-12所述的方法和试剂，脓毒症严重发展的患者其线粒体NCR的酶 活性水平明显降低，低至正常对照酶活性的60%及以下。
【专利摘要】本发明提供一种脓毒症的诊断、危重程度监测和预后评估的方法，即外周血白细胞中线粒体呼吸链超复合物：NADH-细胞色素C氧化还原酶（NADH: cytosome C oxidoreductase，NCR）的酶活性水平，线粒体NCR酶活性水平与脓毒症的器官功能障碍和预后存在密切相关。本发明还提供了一种检测外周血白细胞线粒体呼吸链超复合物NCR酶活性的检测方法和检测试剂。本发明提供的外周血线粒体NCR活性检测的方法可以快速、特异和灵敏的测定样本中线粒体NCR酶活性，对于脓毒症的诊断、危重程度监测和预后评估具有重要意义。
【IPC分类】G01N21-31
【公开号】CN104777109
【申请号】CN201510113753
【发明人】张琪, 朱伟文, 李宁, 郝淑静, 胡洁, 郭琳瑛, 李伟, 卢秀秀, 王志龙
【申请人】首都儿科研究所附属儿童医院, 北京中科非凡生物技术有限公司
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2015年3月16日