一种基于化学发光法检测ca125和sp17含量的试剂盒及方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫分析领域，具体地涉及一种基于化学发光法检测CA125和SP17含 量的试剂盒及方法和应用。
【背景技术】
[0002] 卵巢恶性肿瘤又称卵巢癌，是女性生殖器官常见的肿瘤之一，在女性常见恶性肿 瘤中占2. 4%~6. 5%，发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌而列居第三位。但因卵巢癌致死 者却占各类妇科肿瘤的首位，对妇女生命造成严重威胁。近几年来，对宫颈癌及宫体癌的防 治，取得了一定的成效，而有关卵巢癌的防治方面收效相对较小。因此，在妇女生殖系统癌 瘤中，卵巢癌是造成死亡原因最高的一种肿瘤。北京市8个医院的材料中，卵巢恶性肿瘤占 女性生殖系统恶性肿瘤的22. 9%。造成其病死率居高不下的原因是由于卵巢恶性肿瘤生长 部位隐蔽，无法直接看到，早期卵巢恶性肿瘤症状不明显，仍缺乏简便实用的诊断方法。
[0003] 目前，常见的卵巢癌的免疫学诊断指标包括：①甲胎蛋白（AFP)，是卵黄囊瘤诊断 和治疗监护的重要指标；②绒毛膜促性腺激素（HCG)，可作为观察抗癌治疗效果的指标；③ 肿瘤相关抗原（TAA):国外报道正发现人类卵巢癌存在肿瘤相关抗原，这是存在于肿瘤细 胞膜上的一种表面膜蛋白，特别是源液性和粘液性囊腺癌中，而在正常卵巢组织，良性卵巢 肿瘤均为阴性。
[0004] 近年来血清CA125 (上皮性卵巢癌的单克隆抗体）、CA19-9 (结肠、直肠癌的单克隆 抗体）已被用于监测卵巢癌病人。卵巢癌病人血清CA125高达lOOU/ml以上（正常在35U/ ml以下）者占71%，CA19-9高达100U/ml以上（正常在37U/ml以下）者占30%。但这两 个指标的诊断精确性和灵敏度均不高，目前，尚未发现一个能够实现卵巢癌诊断精确性和 特异性较高的生物标记物。因此急需发明一种新的诊断工具来提高卵巢癌的诊断精确度。
[0005] 血清蛋白17 (SP17)属于肿瘤/睾丸抗原（CTA)家族成员，是一个高度保守的哺乳 动物蛋白，是卵巢癌早期诊断与筛查的生物标记物，它能准确的区分正常卵巢细胞和卵巢 癌细胞，在外周血中检测不到SP17的表达。本发明通过检测自由循环血液中SP17的水平 来实现对卵巢癌的预后和分期的诊断鉴别。在卵巢癌患者体内SP17出现异常表达，而在正 常人体内SP17不表达。由此通过检测SP17的水平，及可实现卵巢癌的早期诊断和预后评 价分析。
[0006] 通常情况下，CA125和SP17的检测方法有RT-PCR和ELISA，但以上两种检测方法 耗时耗力，不能在普通条件下进行简捷操作，本发明通过化学发光的免疫学检测方法，实现 了 CA125和SP17的快速准确检测，为广大患者带来福音。
【发明内容】
[0007] 发明目的：本发明的目的是提供一种基于化学发光法检测CA125和SP17含量的试 剂盒，该检测试剂盒的检测具有简便、快速、灵敏度高、线性范围宽和稳定性好等优点。
[0008] 本发明还要解决的技术问题在于，采用化学发光免疫分析技术对人血清中CA125 和SP17两个指标的水平进行定量检测，实现对卵巢癌的早期诊断与预后评价分析。
[0009] 技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于化学发光法检测 CA125和SP17含量的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括抗异硫氰酸荧光素多克隆抗体 包被的磁微粒、异硫氰酸荧光素标记的CA125单克隆抗体、异硫氰酸荧光素标记的SP17单 克隆抗体、碱性磷酸酶标记的CA125单克隆抗体、碱性磷酸酶标记的SP17单克隆抗体、碱 性磷酸酶催化发光的化学发光底物液、稀释液、清洗液、CA125系列校准品和SP17系列校准 品，其中，本发明的试剂盒的反应试管的材料选自透明的聚苯乙烯、聚乙烯和聚丙烯中的至 少一种。
[0010] 优选地，所述的抗异硫氰酸荧光素多克隆抗体包被的磁微粒由羧基修饰的磁微粒 表面共价结合抗异硫氰酸荧光素多克隆抗体制备得到，其中，所述的磁微粒粒径为0. 7~ 3 ym，内核为四氧化三铁表面包裹有羧基基团。在实际的免疫检测中，由于待测样品中所含 的杂质成分较多，一定程度上影响了检测灵敏度和准确性，所以从复杂的待测样品基质中 快速分离、纯化出目的待测物是临床检验工作者面临的难题之一。磁微粒免疫检测技术是 利用高分子材料合成一定粒度大小的磁性固相微粒作载体，以物理吸附、化学偶联等方法 包被上具有特异性亲和力的抗体或抗原等各种免疫活性物质，具有分离速度快、效率高、可 重复性好、操作简单、不影响被分离细胞或其他生物材料的生物学性状和功能等特点，在外 加磁场作用下可定向运动，使得某些特殊成分得以分离、浓集或纯化。
[0011] 优选地，所述的抗异硫氰酸荧光素多克隆抗体包被的磁微粒悬浮于所述稀释液 中，配制成0. 5~2 μ g/mL的磁微粒溶液；所述异硫氰酸荧光素标记的CA125单克隆抗体和 异硫氰酸荧光素标记的SP17单克隆抗体溶解在所述稀释液中，分别配制成0. 25~0. 5 μ g/ mL异硫氰酸荧光素标记的CA125单克隆抗体溶液和0. 25~0. 5 μ g/mL异硫氰酸荧光素标 记的SP17单克隆抗体溶液；所述碱性磷酸酶标记的CA125单克隆抗体和碱性磷酸酶标记的 SP17单克隆抗体溶解在所述稀释液中，分别配制成0. 25~0. 5 μ g/mL碱性磷酸酶标记的 CA125单克隆抗体溶液和0. 25~0. 5 μ g/mL碱性磷酸酶标记的SP17单克隆抗体溶液。
[0012] 优选地，所述的异硫氰酸荧光素标记的CA125单克隆抗体溶液和异硫氰酸荧光素 标记的SP17单克隆抗体溶液通过透析法制备得到。
[0013] 所述的碱性磷酸酶标记的CA125单克隆抗体和碱性磷酸酶标记的SP17单克隆抗 体通过分别活化CA125单克隆抗体、SP17单克隆抗体以及碱性磷酸酶溶液后，分别将活化 后的CA125单克隆抗体和SP17单克隆抗体与活化后的碱性磷酸酶溶液混合后得到。
[0014] 优选地，所述的化学发光底物液为0. 1~0. 3M、pH值为8~10的Tris-HCl缓冲 液，所述Tris-HCl缓冲液含有0. 2~0. 4mg/mL的二氧杂环乙烷，更优选地，所述Tris-HCl 缓冲液含有〇. 3mg/mL的二氧杂环乙烷
[0015] 所述的稀释液为0. 05~0. 5M、pH值为7. 0~8. 0的Tris-HCl缓冲液且所述稀释 液含0. 4~0. 6wt%的牛血清白蛋白BSA和0. 05~0. 3wt%的叠氮化钠；所述的清洗液为 0. 1~0. 2M、pH值为8~9的Tris-HCl缓冲液，所述Tris-HCl缓冲液含有0. 01~0. 04wt % 的吐温20和15~20wt %的氯化钠，更优选地，所述的清洗液为0. 1Μ、ρΗ值为8的Tris-HCl 缓冲液中加入质量百分比为〇. 02%的吐温20和15%的氯化钠。
[0016] 所述的CA125系列校准品和SP17系列校准品的浓度范围分别为0~50ng/mL和 O ~lOOng/m L。
[0017] 本发明进一步提出了利用权利要求1所述的试剂盒来检测CA125和SP17含量的 方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0018] (1)将试剂盒中的所有试剂取出后平衡到室温；使用前将抗FITC多克隆抗体包 被的磁微粒溶液彻底混匀，确保磁微粒悬浮均匀；用去离子水将清洗液稀释，混匀；设定好 37°C水浴；使化学发光检测仪处于待测状态；
[0019] (2)待测样本或校准品、FITC标记的CA125单克隆抗体溶液和ALP标记的CA125 单克隆抗体溶液混合温育，同时将待测样本或校准品、FITC标记的SP17单克隆抗体溶液分 别与和ALP标记的SP17单克隆抗体溶液混合温育，用多管混匀器振荡混匀，置37 ±0. 5°C水 浴，然后向各个试管中加入抗异硫氰酸荧光素多克隆抗体包被的磁微粒溶液，用多管混匀 器振荡混匀，置37±0. 5°C水浴，试管连架放至磁分离器上，确保试管与磁板接触，沉淀；倒 出上清液，然后加稀释后的清洗液至每一试管中，置多管混匀器振荡混匀；重复上述清洗操 作，共清洗3次；
[0020] (3)加碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物液至每一试管中，混勾，在5分钟内用 发光检测仪进行检测，利用四参数逻辑拟合得到校准品剂量-反应曲线的回归方程，再根 据待测样本的相对发光强度可以从回归曲线上返算出样本中待测物的浓度。
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