一种糖化血红蛋白标准物质及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种糖化血红蛋白标准物质及其制备方法，属于医学检验领域。
【背景技术】
[0002] 糖尿病已成为全球第一大流行病，由糖尿病导致的微血管并发症（视网膜病变、 糖尿病肾病、神经病变和糖尿病足）及大血管并发症（心、脑血管疾病）的发生率、致残率 和致死率极高，严重威胁糖尿病患者的生存质量甚至生命，也给医疗资源和社会经济造成 巨大的负担，因此，糖尿病的早期诊断以及糖尿病患者血糖水平的合理控制是解决问题的 关键所在。糖尿病及其并发症的发生、发展取决于患者体内蛋白长期的糖基化状态，评估这 种糖基化状态的有效方法是检测血液中葡萄糖与血红蛋白的稳定的加合产物一一糖化血 红蛋白，其中血红蛋白A le (HbAlc)是糖化血红蛋白的主要组成成分，大约占糖化血红蛋白的 80%，以HbA1。的结果来报告糖化血红蛋白在业界已达成共识。糖化血红蛋白与传统的诊断 指标血糖相比，具有样本稳定、抽血时间不受限制、不易受干扰等优点，被业界誉为与胰岛 素的发现作用等同。
[0003] HbA1C是世界卫生组织推荐的糖尿病诊断标准（2011年），还是糖尿病血糖控制的 "金标准"，也是评估糖尿病微血管、大血管并发症的有效指标。目前相当一部分国家和地区 采用糖化血红蛋白诊断、管理糖尿病，包括我们的邻国，日本和韩国。册4(3作为糖尿病诊断 标准实施的关键前提是：HbA 1C的检测实现标准化，但我国目前还没有采用糖化血红蛋白诊 断糖尿病，有部分原因是我们的实验室测定结果不准确、不可比，也就是：在我国HbA 1C的检 测还没有实现标准化，使得HbA1C在我国的临床应用没有发挥其应有的作用。
[0004] 2013年，由美国糖尿病协会、欧洲糖尿病研宄会、国际糖尿病联盟及IFCC发表联 合声明：IFCC参考系统是HbA 1C标准化唯一有效的参考系统；HbA1C测定应在全球范围内实 现标准化；HbA1C结果应以IFCC单位（mmol/mol)和NGSP单位（％ )共同报告。
[0005] 由于临床实验室检测HbA1C的常规方法有几十种之多，所用原理不同、方法不同， 所测组分有差异，加上变异血红蛋白等影响因素，导致各实验室之间结果有较大差异。因 此，必须开展HbA 1C检测的标准化工作，以保证各实验室检测结果的溯源性，在此基础上实 现准确性和可比性。标准化工作的核心是建立参考系统，参考系统包括标准物质和参考 方法，标准物质对于实现检测结果的量值溯源，保证检测结果的准确性、可比性有重要意 义。册八^有国际标准物质（IRMM/IFCC-466HbA lC、IRMM/IFCdeTHbA^，是高纯度的基准 标准物质（primary reference material)，二个标准物质以一定的比例混合为IFCC推荐 的、HbA1C 标准化唯一有效的参考测量程序（primary reference measurement procedure) 校准，而作为HbA1C测定结果的量值传递，HbA1C次级标准物质是必不可少的，一些国家 的HbA 1C标准化组织致力于制备形式各异的符合自己需要的标准物质，用于厂家仪器和临 床实验室的校准。但我国没有HbA 1C标准物质，缺少HbA1C检测标准化的基础，为促进我 国HbA1C的检测与临床应用早日与国际接轨，本发明将制备具有医学决定水平的人血基质 HbA1C候选标准物质。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是提供一种糖化血红蛋白标准物质。
[0007] 本发明要解决的另一个技术问题是提供这种糖化血红蛋白标准物质的制备方法。
[0008] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0009] -种糖化血红蛋白标准物质，为3种浓度的具有医学决定水平的人血基质HbA1C 标准物质。
[0010] 所述糖化血红蛋白标准物质的浓度分别为：
[0011] (1)浓度 I :IFCC 值为 31-42mmol/mol 或 NGSP 值为 5. 0-6. 0HbAlc% ;
[0012] (2)浓度 2 :IFCC 值为 43-58mmol/mol 或 NGSP 值为 6. 1-7. 5HbAlc% ;
[0013] (3)浓度 3 :IFCC 值为 69-91mmol/mol 或 NGSP 值为 8. 5-10. 5HbAlc%。
[0014] 所述糖化血红蛋白标准物质的浓度分别为：
[0015] (1)浓度 I : IFCC 值为 38. 42 (不确定度：1. 60) mmol/mol 或 NGSP 值为 5. 67 (不确 定度：0.24) HbAlc % ;
[0016] (2)浓度 2 : IFCC 值为 52. 68 (不确定度：2. 20) mmol/mol 或 NGSP 值为 6. 97 (不确 定度：0· 29)HbAlc% ;
[0017] (3)浓度 3 : IFCC 值为 88. 74 (不确定度：3. 65) mmol/mol 或 NGSP 值为 10. 27 (不确 定度：0. 42)HbAlc%。
[0018] 这3个浓度水平皆为医学决定水平，其中：浓度1为国际诊疗指南推荐的糖尿病筛 查浓度，可以保证糖尿病高危人群的筛查质量；浓度2临近糖尿病诊断标准，可以保证检测 质量，以减少糖尿病的漏诊率和误诊率；浓度3为高值，可用于糖尿病患者的治疗监测、验 证常规方法的检测限及可报告范围。
[0019] 所述糖化血红蛋白标准物质采用以下方法制备：收集不同HbA1。浓度的人新鲜抗 凝全血，在无菌条件下操作制成溶血液，根据糖化血红蛋白的医学决定水平，该标物包括 高、中、低3个不同的浓度水平，分装并在-70°C下保存。具体包括以下步骤：
[0020] (1)用EDTA抗凝采血管采集空腹静脉血50ml/人，室温放置0. 5小时，将采血管于 8°C 3000g离心10min，去除上层血衆；
[0021] (2)向下层红细胞中加入10倍体积的0· 15mol/L NaCl溶液，置37°C温浴4h，离心 20min，弃去上清液，重复该步骤，清洗红细胞2次；
[0022] (3)加入等体积超纯水，混勾，裂解红细胞；
[0023] (4)去除细胞碎片等杂质：离心20min，小心吸取上层溶液，加入IOml含稳定剂的 水溶液，混匀后，用针头滤器过滤溶血液，测定总血红蛋白浓度；
[0024] (5)按糖化血红蛋白水平混合成3种浓度的标准物质；
[0025] (6)在无菌间将溶血液分装至Iml聚乙烯管中，加盖，编号，置-70°C保存。
[0026] 所述步骤⑷所述的稳定剂水溶液为50mmol/Lβ -吗啉乙磺酸、10mmol/L KC1、 lmmol/L Na2CO3, pH 值为 6. 2。
[0027] 一种糖化血红蛋白标准物质的制备方法，包括如下步骤：
[0028] (1)用EDTA抗凝采血管分别采集健康无糖尿病者、糖尿病控制良好者及糖尿病控 制不好者的空腹静脉血50ml/人，室温放置0. 5小时，将采血管于8°C 3000g离心10min，去 除上层血浆；
[0029] (2)向下层红细胞中加入10倍体积的0· 15mol/L NaCl溶液，置37°C温浴4h，离心 20min，弃去上清液，重复该步骤，清洗红细胞2次；
[0030] (3)加入等体积超纯水，混勾，裂解红细胞；
[0031] (4)去除细胞碎片等杂质：离心20min，小心吸取上层溶液，加入IOml含稳定剂的 水溶液，混匀后，用针头滤器过滤溶血液，测定总血红蛋白浓度；
[0032] (5)按糖化血红蛋白水平混合成3种浓度的标准物质；
[0033] (6)在无菌间将溶血液分装至Iml聚乙烯管中，加盖，编号，置-70°C保存。
[0034] 所述步骤（4)的稳定剂水溶液为50mmol/L β -吗啉乙磺酸、10mmol/L KC1、Immol/ L Na2CO3, pH 值为 6. 2。
[0035] 所述步骤⑷测定总血红蛋白浓度的方法为氰化高铁血红蛋白测定法。
[0036] 所述步骤（5)的3种浓度的标准物质为：
[0037] (1)浓度 I :IFCC 值为 31-42mmol/mol 或 NGSP 值为 5. 0-6. 0HbAlc% ;
[0038] (2)浓度 2 :IFCC 值为 43-58mmol/mol 或 NGSP 值为 6. 1-7. 5HbAlc% ;
[0039] (3)浓度 3 :IFCC 值为 69-91mmol/mol 或 NGSP 值为 8. 5-10. 5HbAlc%。
[0040] 所述步骤（5)的3种浓度的标准物质为：
[0041] (1)浓度 I : IFCC 值为 38. 42 (不确定度：1. 60) mmol/mol 或 NGSP 值为 5. 67 (不确 定度：0.24) HbAlc % ;
[0042] (2)浓度 2 :IFCC 值为 52. 68 (不确定度：2. 20)mmol/mol 或 NGSP 值为 6. 97 (不确 定度：0· 29)HbAlc% ;
[0043] (3)浓度 3 : IFCC 值为 88. 74 (不确定度：3. 65) mmol/mol 或 NGSP 值为 10. 27 (不确 定度：0. 42)HbAlc%。
[0044] 所述糖化血红蛋白标准物质用于检测人糖化血红蛋白常规方法的发展、溯源、评 价，试剂的制备及质量评价，校准物的制备、定值及质量评价的应用。
[0045] 所述糖化血红蛋白标准物质用于制备检测糖尿病的试剂的应用。
[0046] 本发明的优点是：该标准物质具有良好的均匀性、稳定性及互通性，符合HbA1。国 际标准化工作的要求、《一级标准物质技术规范》及ISO Guide35的要求；标准物质采用新 鲜血液制备溶血液，来源广泛，使用方便；制备方法简单，溶血液无须经过二D电泳或HPLC 液相色谱的纯化，适合于常规方法使用；此标准物质在4°C可储存1个月，在_70°C可长期储 存，便于运输，对于常规检测系统的溯源和质量评价、试剂的制备及质量评价、校准物的制 备、定值及质量评价以及协作研宄分析中的质量保证都可发挥作用。
[0047] 以下结合【具体实施方式】详细说明本发明技术方案，并不以此限定本发明的实施范 围。凡依照本发明公开内容所做的本领域等同替换，均属于本发明的保护范围。
【具体实施方式】
[0048] 实施例1 :制备糖化血红蛋白标准物质
[0049] 一 ·材料
[0050] 1.包装容器的选择
[0051] 聚乙烯材料对候选标准物质基质中的成分没有吸收和释放，耐热、抗酸、抗碱、抗 水，因此选择无菌聚乙烯管（Axygen公司，美国）作为标准物质的容器。
[0052] 2.消毒
[0053] 在制备前，无菌间和超净台紫外消毒。
[0054] 3.采血志愿者选择
[0055] 健康无糖尿病、糖尿病控制良好及糖尿病控制不好志愿者，年龄20~50岁、男女 各半，人类免疫缺陷病毒抗体（HIV)和乙型、丙型肝炎表面抗原（HBV、HCV)阴性，填写知情 同意书。
[0056] 4.试剂
[0057] 乙腈，色谱纯（Acetonitrile, Fisher公司，美国），β -吗啉乙磺酸（MES，Sigma 公司，美国），乙二铵四乙酸二钠（Na2-EDTA)、氯化钠（NaCl)、氯化钾（KCl)、碳酸氢钠 (NaHCO 3)为分析纯（北京化学